[发明专利]一种具有高热稳定性的牡蛎铁蛋白及其制备方法

说明书

本发明公开了一种具有高热稳定性牡蛎铁蛋白以及制备方法，上述牡蛎铁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，将野生型牡蛎铁蛋白第120位的天冬氨酸突变为甘氨酸，核苷酸由gcc突变为gac。本发明方法为：以牡蛎为原料，重组表达牡蛎铁蛋白，通过点突变将铁蛋白三重轴处带有负电荷的天冬氨酸突变为不带电的甘氨酸，经细胞超声破碎、硫酸铵沉淀与弱阴离子交换柱层析获得高纯度的具有高热稳定性的牡蛎铁蛋白。本发明使铁蛋白热稳定性由76℃提高至87℃，同时仍具有一定的生理活性；本发明操作简单，条件可控性强，其最大优势在于可在相对较高的温度条件下保持牡蛎铁蛋白的生理活性并仍具有独特的自组装特性，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种具有高热稳定性的牡蛎铁蛋白以及基于基因工程手段制备的方法。

背景技术

铁蛋白于1937年从脊椎动物马的脾脏中纯化分离出来，并发现铁蛋白广泛存在于脾脏、肝脏、肾脏、骨髓、心脏、胰腺、肠、胎盘等代谢活跃的组织及脊椎动物的血液中，具有耐稀酸pH＝2、耐稀碱pH＝12和耐较高温度70～75℃不变性等特性。铁蛋白外形结构呈球形，由蛋白壳和铁核两部分组成，前者是由24个亚基高度对称性地组成的内空腔结构，而后者是由数千氢氧化铁分子和数百磷酸盐分子组成非均匀的铁核结构，并可划分为高磷铁比的铁核表层和低磷铁比铁核内层结构。铁蛋白广泛存在于动物、植物和微生物中。当细胞内二价铁离子含量高时，铁蛋白通过它的亚铁氧化还原中心，在氧气的协助下，将其催化氧化生成无毒的三价铁储藏在它的内部，1分子铁蛋白最多可储存4500个三价铁，这个特点是铁蛋白与其它酶最大的不同之处。当细胞需要铁时，铁蛋白在还原剂的帮助下，将三价铁还原为二价铁离子从其内部释放出来，以供其它蛋白质合成利用，所以铁蛋白在细胞内具有去除二价铁离子的毒性以及调节铁代谢平衡的双重作用，具有重大的生物学活性。Durand等人研究证明可采用离子交换色谱法和高效液相色谱法从牡蛎内脏中分离纯化铁蛋白。SDS-PAGE电泳上显示一个20kDa的条带。牡蛎铁蛋白cDNA的氨基酸序列比对结果表明，它们与合浦珠母贝、静水椎实螺和勃艮第蜗牛具有一致性。同时实验证明，负责氧化铁酶中心的残基存在于牡蛎铁蛋白亚基中。

目前，由于天然纯化所得铁蛋白含量有限且价格昂贵，因此铁蛋白无法大量适用于实验研究以及药物开发体系中。天然牡蛎铁蛋白的热变性温度为76℃，虽具有相对较好的耐热性，但随着温度进一步升高，铁蛋白的应用仍有一定的限制。因此，基因原核表达不仅可以提高表达效率，并且价格相对低廉，适合大批量生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高热稳定性的牡蛎铁蛋白以及其制备方法。本发明通过改变野生型牡蛎铁蛋白的氨基酸序列，从而改变牡蛎铁蛋白的三重轴附近环境，从而提高牡蛎铁蛋白的耐热程度，扩大铁蛋白的应用范围。本发明首次对野生型牡蛎铁蛋白进行点突变，增加其耐热能力，具有较高的实际意义和应用前景。可用于贮藏铁以供人类需要或作为载体传递营养物质等领域。

本发明通过点突变改变野生型牡蛎铁蛋白的氨基酸序列，构建一种新的铁蛋白。所述的野生型牡蛎铁蛋白氨基酸序列由NCBI网站提供(Gene ID：LOC105327516)，将所述野生型牡蛎铁蛋白氨基酸序列中第120位的天冬氨酸突变为甘氨酸，核苷酸由gcc突变为gac，获得一种具有高热稳定性的牡蛎铁蛋白。铁蛋白由于其独特的结构，可装载小分子物质或其他营养物质，因此可以作为一种运输载体传输机体所需物质。成功获得此蛋白可以扩大铁蛋白的使用范围。

一种具有高热稳定性的牡蛎铁蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，分子量为480kDa；或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。

编码所述具有高热稳定性的牡蛎铁蛋白的基因mGF1，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了一种上述具有高热稳定性的牡蛎铁蛋白的制备方法，包括步骤：

S1、获得编码上述具有高热稳定性的牡蛎铁蛋白核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；