[发明专利]一种叶酸代谢能力基因MTHFR和MTRR多态性检测试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种叶酸代谢能力基因多态性位点的基因型分型检测试剂盒及方法。所述试剂盒，包括突变型反应体系和野生型反应体系；反应体系包括rs1801133组、rs1801131组和rs1801394组，并公开了每组的引物、探针和抑制剂的结构。本发明解决了在叶酸代谢能力基因MTHFR和MTRR多态性分型检测中模板质量要求高，时效性不足的问题，仅需要两管反应体系，一次性加样，一次性闭关检测，就可实现MTHFR基因677CT、1298AC和66AG三个位点多态性即时检测，体系稳定，灵敏度特异性好。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种叶酸代谢能力基因MTHFR和MTRR多态性检测的试剂盒和使用方法。

背景技术

叶酸是细胞生长和组织修复所必需的物质，在胚胎发育过程中，对孕妇尤其重要。据我国婚前育龄女性血清抽样调查发现，我国城市和农村女性缺乏叶酸者分别有21％和38％。据卫生部及疾控中心相关报告，我国每年有90万新生儿缺陷性疾病诞生，患出生缺陷排在前5位的包括：先天性心脏病，神经管畸形，唇腭裂，唐氏综合征，多指(趾)，这些都与孕妇叶酸缺乏有一定关系。

近年来的研究表明，叶酸代谢能力在个体间的差异与部分基因位点的多态性有关。参与到叶酸代谢途径的酶有多种，包括二甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸还原酶(MTR)、甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)和胱硫脒β合酶(CBS)等，这些酶的某些核苷酸多态可导致叶酸代谢异常而引起疾病或出生缺陷。二甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)第677位碱基CT变异(rs1801133)，可导致MTHFR蛋白第222位的丙氨酸被缬氨酸取代。MTHFR杂合变异型(677CT)和纯合变异型(677TT)，在中国人群中的百分比分别为44％和23％。MTHFR纯合变异型(677TT)人群高同型半胱氨酸(Hcy)水平显著升高，大量流行病和临床研究都证实TT基因型和高Hcy是脑卒中发生的独立危险因素。MTHFR第1298位碱基AC变异(rs1801131)，可使MTHFR蛋白第433位的谷氨酰胺被丙氨酸取代；杂合变异型(1298AC)和纯合变异型(1298CC)，在中国人群中的百分比分别为29.3％和3.9％；杂合突变型和纯合突变型相比野生型，MTHFR酶活性有所下降，甚至只能达到野生型酶活性的30％左右，导致血清叶酸和维生素B12水平下降，血浆中同型半胱氨酸水平升高。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)主要变异型有十余种，其中A66G是最主要和研究最多的突变。MTRR基因第66位碱基AG变异(rs1801394)，导致MTRR蛋白氨基酸链残基22位蛋氨酸被异亮氨酸替代，引起酶的活性降低，导致同型半胱氨酸血症，增加神经管畸形和先天性心脏病等出生缺陷性疾病的发病风险。其中杂合变异型(66AG)和纯合变异型(66GG)在中国人群中占36％和6％。

利用基因分型技术检测孕妇叶酸代谢相关基因型MRHFR和MTRR基因多态性，对受检者叶酸利用能力进行分级，进而针对性的调整叶酸补充剂量。当前市场上检测基因多态性的方法很多，包括如基因芯片法、基因测序、限制性片段长度多态性(RFLP)、溶解曲线等。其中基因测序为突变检测的金标准，但因其所需时间长，费用高，对取材要求严格，限制了在临床中的使用。RFLP仅适用于突变位点附近存在适当的特定限制性内切酶识别序列的情况，应用局限性较大。基于荧光定量PCR，通过溶解曲线对叶酸代谢能力基因MRHFR和MTRR多态性分型也是常用的方法。但是溶解曲线结果判读不明显，容易受到检测条件和模板质量的影响，对检测人员的操作性和经验要求较高。目前，ARMS-PCR和taq-man探针也被用于MRHFR和MTRR基因多态性分型，主要是通过Ct值进行判读，易出现假阳性和假阴性结果(Delgado-Plasencia,et al.2015；Saxena,et al.2016；Shi,et al.2019；Singh,etal.2015)；而且，对于使用的DNA模板质量要求高，如DNA模板的浓度需要进行提前检测限定，蛋白含量、小分子杂质含量等不同的DNA模板质量及DNA模板浓度得到的检测Ct值不同，对结果的判读影响很大。

发明内容