[发明专利]用于外源蛋白分泌的糖苷水解酶融合表达系统

说明书

本发明提供一种能改善外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌生产的融合表达系统，所示融合表达系统包含一种与外源蛋白融合的天然糖苷水解酶。本发明还提供利用所述融合表达系统生产外源蛋白的方法。

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体地涉及一种基于糖苷水解酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)融合表达系统。本发明还涉及利用所述融合表达系统在枯草芽孢杆菌中分泌生产外源蛋白的方法。

发明背景

蛋白质的重组生产是现代生物技术和酶工业应用中的重要技术之一。与胞内生产相比，由于分泌过程有利于蛋白质在低还原环境下折叠、可溶性表达及生物活性保持，同时分泌蛋白易于纯化，简化了下游操作步骤，所以分泌表达是一种理想的外源蛋白生产方式。枯草芽孢杆菌是一般认为安全(Generally Recognized As Safe,GRAS)的食品级微生物，具有较好的分泌能力、易于培养、不产生内毒素、遗传操作相对简单和发酵工艺成熟等优点，被认为是理想的外源蛋白表达宿主菌。目前为止许多来源于不同生物的外源蛋白已经在B.subtilis中实现了分泌表达，但分泌量低这一瓶颈仍未得到解决。其中，外源大蛋白，例如分子量大于80kDa的大蛋白的分泌尤为困难。目前，除芽孢杆菌属的两个普鲁兰酶以较高水平分泌外，仅极少数80kDa以上的外源蛋白在枯草芽孢杆菌中成功分泌，且分泌量非常低，仅有几十毫克每升。因此，亟需有效改善外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌生产的方法。

发明内容

本发明人发现将编码来源于枯草芽孢杆菌的糖苷水解酶家族5葡聚糖内切酶(B.subtilis native glycoside hydrolase family 5endoglucanase，BsCel5)的DNA片段与编码目的蛋白的第二个DNA片段融合在一个读码框中时，所编码的融合蛋白的分泌水平明显提高。本发明人还发现，BsCel5能够有效改善外源大蛋白，例如分子量大于80kDa的外源蛋白的分泌。因此，本发明的第一个方面提供基于糖苷水解酶的融合表达系统。

所述融合表达系统包含能够编码至少以下元件的DNA序列，所述元件包括信号肽、糖苷水解酶和外源蛋白，并且依上述顺序排列融合在一个开放读码框内。

所述糖苷水解酶包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。所述氨基酸序列包含纤维素结合模块(CBM)，其能够有效结合纤维素，从而便于融合蛋白的回收。优选地，所述糖苷水解酶为枯草芽孢杆菌天然糖苷水解酶家族5葡聚糖内切酶BsCel5，其序列如SEQ ID NO.2所示。编码BsCel5的DNA序列在SEQ ID NO.1中示出。

任选地，糖苷水解酶和外源蛋白之间可插入接头序列、用于蛋白酶剪切的靶位点或内含肽。

任选地，信号肽和糖苷水解酶之间可插入前肽序列以提高融合蛋白的分泌水平。

本领域技术人员可以理解，本领域已知的可在枯草芽孢杆菌中起作用的各种信号肽均可用于本发明，包括但不限于，来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶nprB信号肽、来源于枯草芽孢杆菌的α淀粉酶amyE信号肽和来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的amyL信号肽。优选地，本发明中使用的信号肽为来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶nprB信号肽。

本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种枯草芽孢杆菌菌株均可用作本发明的融合表达系统中的宿主。优选地，所述枯草芽孢杆菌宿主为敲除蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，包括但不限于WB800、WB600、SCK6、1A751。更优选地，所述枯草芽孢杆菌宿主为敲除蛋白酶和α淀粉酶的菌株。

可将糖苷水解酶蛋白序列最小化至某种程度而仍维持其在融合蛋白表达中使用时的有利特性。这种对DNA序列以及因此所编码的蛋白质序列的最小化可通过分子生物学领域已知的任何方法实现。

本发明的第二个方面提供利用所述融合表达系统在枯草芽孢杆菌中分泌生产外源蛋白的方法。所述方法包括下述步骤：