[发明专利]一种检测CALM2基因表达水平的试剂的应用

说明书

本发明公开了检测CALM2基因表达水平的试剂在菌阴性肺结核诊断中的应用。本发明设计得到人CALM2基因的荧光定量PCR扩增引物F：AGTGCTGCAGAACTTCGCCATG；R：CAAGGTCTTCACTTTGCTGTCATC。实现了通过提取人外周血白细胞的RNA，实时检测CALM2基因表达水平的技术效果，用于区分健康人与菌阴肺结核患者，灵敏度和特异性都可达到80％以上，从而更加有针对性的采取肺结核治疗和隔离措施。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测CALM2基因表达水平的试剂在菌阴性肺结核诊断中的应用。

背景技术

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌感染引起的严重危害人类健康的重大传染病。尽管目前已有有效的抗结核药物，但由于结核感染率高，耐药问题严重，目前结核病仍然是感染性疾病中的头号杀手。全球每年约200万人死于结核病，防控形势十分严峻。及早诊断活动性结核患者既是提高治疗效果的关键，也是有效控制结核病传播的关键。痰结核分枝杆菌微生物检查特异性高，是当前诊断活动性肺结核的金标准，但灵敏度低，痰菌呈现阴性的肺结核患者占总的结核病人的60％～70％。菌阴肺结核的存在，加大了对结核诊断方法的要求。尽管当前已出现了多种基于免疫学、分子生物学、酶学等学科的诊断新技术，但即使多种诊断技术相结合，菌阴肺结核的诊断仍然较低，早期诊断率更低，并且由于结核发病和艾滋病等其他疾病合并症，最近几年反而有下降趋势，特别是菌阴肺结核的诊断仍属重大难点。因此，寻找新诊断靶点、开创新诊断方法已成为当务之急！

近几年众多科技人员一直在努力研究人外周血细胞分子的表达与结核病发病关系，寻找能够诊断菌阴肺结核病的分子标志物。CALM2分子是细胞内钙传导器蛋白，当细胞内Ca²⁺浓度增加时，CALM2可结合多达4个Ca²⁺，改变构象，调节细胞功能，如激活或抑制大量的酶、离子通道和受体。

发明内容

本研究发现，相对于健康人，在菌阴结核病患者外周血中CALM2基因的表达显著下降，因此CALM2基因的表达水平可以用来作为菌阴肺结核的新靶点分子，用于区分非结核感染与菌阴结核感染，从而更加有针对性的采取肺结核治疗和隔离措施。

本发明所采取的技术方案是：

检测CALM2基因表达水平的试剂在制备菌阴性肺结核诊断试剂盒中的应用。

上述检测CALM2基因表达水平的试剂含有CALM2 mRNA扩增引物序列组和/或核酸探针。

作为上述试剂的进一步改进，CALM2 mRNA扩增引物序列如下：

CALM2 mRNA扩增正向引物序列为：AGTGCTGCAGAACTTCGCCATG(SEQ ID NO.1)；CALM2 mRNA扩增反向引物序列为：CAAGGTCTTCACTTTGCTGTCATC(SEQ ID NO.2)。

作为上述试剂的进一步改进，探针为Taqman探针和/或Beacon探针。

一种同时定性/定量检测CALM2基因表达水平的方法，包括如下步骤：

1)从样品中提取RNA，加入反转录引物进行反转录，得到cDNA；

2)以cDNA为模板，使用引物进行PCR扩增反应，扩增反应的同时加入探针，对扩增产物进行分析，判断CALM2 mRNA的荧光定量反应值，即可；

其中，扩增引物为上述CALM2 mRNA扩增引物序列；

探针为上述Taqman探针和/或Beacon探针；

所述方法不用于疾病的诊断和治疗。

作为上述方法的进一步改进，PCR扩增反应体系如下：

Sybrgreen PCR 10×Buffer：5μL；