[发明专利]用于荧光定量PCR检测MTHFR基因多态性的方法

权利要求书

1.一种用于荧光定量PCR检测MTHFR基因多态性的引物探针组合，其特征在于，包括两组引物对和双探针对，其中第一组引物对和双探针对的核苷酸序列：上游引物由SEQ IDNO.1所示，下游引物由SEQ ID NO.2所示，荧光探针1由SEQ ID NO.3所示，荧光探针2由SEQID NO.4所示；第二组引物对和双探针的核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.5所示，下游引物由SEQ ID NO.6所示，荧光探针1由SEQ ID NO.7所示，荧光探针2由SEQ ID NO.8所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一组引物探针用于检测MTHFR基因的c.677C＞T位点，第二组引物探针用于检测MTHFR基因的c.1298A＞C位点。

3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述两组的荧光探针在5′末端区域标记有荧光基团，在3′末端区域标记有淬灭基团，两组中的荧光探针1和荧光探针2的荧光基团均不相同。

4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、TET、VIC、ROX、Texas Red-X、Cy3、Cy5；淬灭基团选自TAMRA、BHQ、DABCYL、NFQ-MGB。

5.根据权利要求3或4所述的引物探针组合，其特征在于，所述两组中的荧光探针，荧光探针1的5′端标记有FAM的荧光基团，荧光探针2的5′端标记有VIC荧光基团，所有荧光探针的3′端均标记有NFQ-MGB的淬灭基团。

6.权利要求1-5任一项所述的引物探针组合应用于制备荧光定量PCR检测MTHFR基因多态性的试剂盒中。

7.一种用于荧光定量PCR检测MTHFR基因多态性的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的引物探针组合。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、dNTPs和超纯水。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包含待测样品DNA提取试剂或DNA提取试剂盒。

10.一种用于荧光定量PCR检测MTHFR基因多态性的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的引物探针组合对待测样品进行荧光定量PCR检测，包括步骤：

(1)从待测样品中提取基因组DNA，作为扩增模板；

(2)配制包含所述引物探针组合和所述扩增模板的荧光定量PCR反应体系，各反应体系中，上下游引物的终浓度均为0.2-1.0μM；荧光探针的终浓度均为0.05-1.0μM；

(3)荧光PCR扩增反应，条件：90-98℃，预变性，5-20min；90-98℃，变性，10-50s；55-69℃，退火，60-120s；68-72℃，延伸，15-300s；30-50个循环；

(4)扩增完成后，根据散点图自动读取基因型，每一个点代表一个样品，每个数据集代表一种基因型：野生型：CC或AA；杂合突变型：CT或AC；纯合突变型：TT或CC；空白对照：NTC。