[发明专利]K-ras基因突变位点检测试剂盒

说明书

本发明涉及分子生物技术和基因检测领域，具体而言，涉及一种K‑ras基因突变位点检测试剂盒，该试剂盒包括：a)引物对；b)上游探针、下游探针、发夹探针；以及c)两种纳米金探针。上述引物和探针能够实现在闭管条件下对K‑ras基因的突变位点进行高灵敏、高分辨、低成本检测，能够有效的避免扩增产物的交叉污染。其中下游探针既可单独使用，也可互相配合在同一反应体系下进行多重检测，因而本试剂盒能够对最多七种K‑ras基因突变位点同时进行检测，检测效率更高。

技术领域

本发明涉及分子生物技术和基因检测领域，具体而言，涉及一种K-ras基因突变位点检测试剂盒。

背景技术

K-ras是EGFR信号通路下游的一种小分子G蛋白，突变后抑制了自身的GTP酶活性，使得K-ras蛋白总是处于活化状态，导致信号通路不受上游EGFR信号指令的调控。结直肠癌患者中K-ras基因的突变率约为40％，70％发生于第12位密码子，30％发生于13位密码子。K-ras基因突变状态与西妥昔单抗疗效相关，K-ras基因发生突变时西妥昔单抗治疗无效，因此，针对K-ras基因突变进行分子分型检测，针对其突变情况制定给药方案具有十分必要性。然而通常情况下，在实际临床样本中，突变基因通常混在大量野生型基因序列中，而由于两者之间的序列常常仅有一个碱基的差异，因此针对性的检测突变基因的难度很大。基于此，目前针对这类的基因位点检测多是基于特异性较高的分子检测方法完成，使用较多的技术平台是ARMS技术和NGS技术，这两种方法均能够检测低至1％左右的基因突变，但是由于试剂盒的成本较高(或者对操作者的要求较高)，给患者带来较大的经济负担。

发明内容

本发明通过纳米金探针与模板杂交与否会引起特征吸收波长发生规律性变化来实现突变位点的检测，由于不需要昂贵的机器，也不需要复杂的操作，是一种较现有方法更为快速简单经济的K-ras基因突变检测方法。

具体的，本发明涉及一种K-ras基因突变位点检测试剂盒，包括：

a)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；

b)SEQ ID NO：3所示的上游探针、SEQ ID NO：4～10所示的下游探针中的至少一条、SEQ ID NO：11所示的发夹探针；以及

c)两种纳米金探针，其各自包含SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示核酸片段。

上述引物和探针能够实现在闭管条件下对K-ras基因的突变位点进行高灵敏、高分辨、低成本检测，能够有效的避免扩增产物的交叉污染。其中下游探针既可单独使用，也可互相配合在同一反应体系下进行多重检测，因而本试剂盒能够对最多七种K-ras基因突变位点同时进行检测，检测效率更高。

根据本发明的再一方面，还涉及一种组合物，其由如上所述的K-ras基因突变位点检测试剂盒混合配制得到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所提供试剂盒的使用原理示意图；

图2为本发明一个实施例中K-ras基因七种突变位点独立检测结果；

图3为本发明一个实施例中K-ras基因七种突变位点同管多重检测结果；

图4为本发明一个实施例中K-ras基因突变位点检测试剂在模板用量为3×10⁴拷贝下的灵敏度检测结果；

图5为本发明一个实施例中K-ras基因突变位点检测试剂在模板用量为3×10³拷贝下的灵敏度检测结果；