[发明专利]一种烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法、应用

说明书

本发明属于植物病毒纯化技术领域，公开了一种以烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法、应用，以发病本氏烟为砧木，以番茄植株为接穗，利用劈接法将接穗嫁接到砧木上。待接穗番茄长到一叶期，从番茄根部切断，保留地上部分作为接穗，接穗番茄下部左右各斜切一部分韧皮部，插入本氏烟植株切口，用嫁接夹固定。本发明ToCV侵染性克隆能成功侵染本氏烟，且发病症状明显，而ToCV侵染性克隆直接接种番茄植株，其侵染率极低，且不表现症状，烟粉虱取食该番茄植株48h后体内未检测到病毒片段；本发明采用劈接法嫁接的番茄植株发病率高达79.08％，更适用于本氏烟为砧木番茄植株的嫁接。

技术领域

本发明属于病毒纯化技术领域，尤其涉及一种烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法、应用。

背景技术

番茄褪绿病毒是由粉虱类害虫传播的一种新发病毒，侵染寄主植株引起严重的“黄化失调”，导致果实成熟延迟，影响产量，给种植户带来巨大的经济损失。该病害于1989年在美国弗罗里达州番茄种植区被发现，1998年首次被确定为番茄褪绿病毒，随后迅速在全球范围内暴发、流行。根据文献统计发现，除南极洲和大洋洲之外，其余5大洲20多个国家和地区均有ToCV的报道。我国首次于2004年在中国台湾检测到ToCV的发生，2012年在中国北京大兴区设施番茄和辣椒植株上检测到该病毒。目前，ToCV已在北京、山东、河南、天津、山西、江苏、辽宁、广东等番茄种植区暴发、流行，造成了严重的经济损失。

ToCV属于长线形病毒科Closteroviridae毛形病毒属Crinivirus，其基因组包含两条正义单链RNA(+ssRNA)，分别包装在线形的病毒粒子中。RNA1长8594nt，包含4个ORFs，编码的蛋白控制病毒复制。RNA2长8242nt，包含9个ORFs，编码的蛋白与病毒壳体化、运动及介体传播相关。先前的研究发现，RNA1链和RNA2链同时存在才能确保成功侵染寄主细胞。如同其它毛形病毒属病毒一样，ToCV是韧皮部限制性病毒，不能通过人工机械摩擦接种，也不经由种子传播。自然条件下，ToCV只能通过粉虱以半持久性方式传播，分属于小粉虱属Bemisia和粉虱属Trialeurodes的烟粉虱Bemisiatabaci、温室白粉虱Trialeurodesvaporariorum和纹翅粉虱T.abutilonea通过刺吸取食植株韧皮部位传播病毒。虽然这几种粉虱的传毒效率有所差异，但都具备有效传播能力。

解决上述技术问题的难度：实验室内通常利用粉虱取食带毒植株进行病毒保存，但粉虱作为多种植物病毒的传毒媒介，很难保证病毒单一侵染(Andret-Link P and FuchsM,2005；Hohn,2007)。同时粉虱接种还受到性别、饲养、技术等多种因素的影响，而且操作复杂，接种率较低。常规的嫁接接种以发病的番茄植株为砧木，由于番茄植株可以通过媒介昆虫获得多种病毒，因此很难保证毒源单一。

解决上述技术问题的意义：针对媒介昆虫传毒接种和常规番茄嫁接接种存在方法上的缺陷，本发明提供了一种以烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的方法，该方法适用于韧皮部植物病毒的嫁接接种，接种率高达80％，操作简单、快速有效，在实验室内重复性强，对ToCV致病机理、媒介昆虫-病毒-寄主互作机制、抗性品种选育等方面提供技术支持。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法、应用。

本发明是这样实现的，一种烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法，所述烟草为砧木嫁接接种番茄褪绿病毒的纯化方法以发病本氏烟为砧木，以番茄植株为接穗，以健康番茄植株为接穗，劈接法将接穗番茄嫁接到砧木上。待接穗番茄长到一叶期，从番茄根部切断，保留地上部分作为接穗，接穗番茄下部左右各斜切一部分韧皮部，插入本氏烟植株切口，用嫁接夹固定。