[发明专利]编码杀虫蛋白抗虫融合基因mCryAb-VIP3A、其表达载体及其应用

说明书

本发明公开了一种编码杀虫蛋白抗虫融合基因mCryAb‑VIP3A、其表达载体及其应用，旨在解决昆虫对杀虫制剂的抗药性趋势不可遏制的技术问题。本发明设计了抗虫基因和抗虫融合基因mCryAb‑VIP3A，还提供了抗虫融合基因编码的蛋白，并设计了由抗虫融合基因构建的表达载体、由表达载体构建的重组菌。将抗虫融合基因在制备抗虫植物细胞中应用。将抗虫融合基因编码的蛋白在制备抗虫制剂中应用。本发明抗虫融合基因能在玉米中稳定表达，避免了原始VIP3A(a)基因单独转入植物产生的生物毒性，克服了外源基因表达存在的基因沉默现象，为植物害虫防治提供更多的选择，为遏制昆虫对杀虫制剂的抗药性趋势提供了新的方法。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种编码杀虫蛋白抗虫融合基因 mCryAb-VIP3A、其表达载体及其应用。

背景技术

以农作物为食的害虫达百万种之多，造成巨大的经济损失，严重影响作物产量和品质。目前农作物害虫的防治主要还是依赖于化学农药，长期大量使用化学农药对环境和健康造成很大的危害。为了减少环境污染和对人类健康潜在的危害，利用生物技术开发新型药剂成为研究热点。

随着分子生物学技术的发展和基因克隆、DNA操作等技术出现，人类开始将抗虫基因克隆到工程菌中，进一步获得了抗性转基因植株，其中很多已进入大田试验，甚至有的已经开始大面积种植。

优良目标基因的选择和克隆是基因工程研究的基础，现有抗虫基因的克隆主要有：

苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis，Bt）抗虫基因：Bt在形成芽孢的过程中产生的杀虫蛋白晶体，敏感性昆虫摄取后，在中肠碱性条件下被水解为多肽，可使细胞膜上形成孔道，进而破坏细胞的离子平衡，最终导致细胞裂解，致使昆虫死亡；蛋白酶抑制剂基因：对维持生物体正常代谢和预防外来蛋白水解酶对基体的破坏起着重要作用，可抑制昆虫肠道蛋白酶活性，造成昆虫消化不良，最终因缺乏氨基酸，生长发育受限继而死亡；植物凝集素基因：含二价金属离子的糖蛋白，可使昆虫，尤其是刺吸式口器的昆虫，红细胞发生凝聚作用，进而引发死亡；几丁质酶基因：几丁质是真菌细胞壁、昆虫外壳的重要组成部分，几丁质酶广是一种泛存在于植物中的内源性蛋白质，具有抵御病原性真菌、食草昆虫的重要作用；蝎昆虫毒素基因：可特异性结合于昆虫神经细胞膜上的钠离子通道，引起钠离子的通透性改变，从而使昆虫麻痹、死亡。

目前从大量的Bt菌株中分离出至少90种基因编码的杀虫结晶蛋白。昆虫病原菌Bt基因产生Cry、Cyt和Vips等3种蛋白。Cry和Cyt蛋白产生聚集在包涵体或旁孔晶体中的杀虫蛋白，Cry蛋白根据蛋白结构同源性和寄主范围，将这些基因划分为CryI、CryII、CryIII和CryIV4个主要类型。其中，CryI高抗鳞翅目昆虫，CryII抗鳞翅目和和双翅目昆虫，CryⅢ高抗鞘翅目昆虫，CryIV抗双翅目昆虫。近年又相继发现了兼抗鳞翅目和鞘翅目的Bt毒蛋白（CryV）、抗线虫的Bt毒蛋白（CryVI）。大多数苏云金芽孢杆菌株系可产生几种杀虫结晶蛋白，但每一种杀虫结晶蛋白寄主范围相当狭窄。

除上述几类外，还有豌豆脂氧合酶基因、昆虫雌虫不育蛋白因子基因、昆虫保幼激素脂酶基因、昆虫神经激素基因等等。

但是，上述转抗虫基因的抗虫植物在应用中的潜在问题也日益显露，影响其持续利用。如：将原始抗虫基因直接应用到转基因植物中获得的转基因植物抗虫性很低、抗虫性效果差，毒蛋白的表达量低量也很低且表达产物不稳定，不能满足农业生产上的虫害防治需求，大多难以推广应用；随着抗虫基因的大范围应用，昆虫还会对杀虫蛋白还会产生抗性；抗虫基因的抗虫谱窄；外源基因在植物体内的表达存在基因“沉默”现象，等等。