[发明专利]一种快速检测紫藤脉花叶病毒的LAMP引物组、试剂盒和方法

权利要求书

1.一种快速检测紫藤脉花叶病毒的LAMP引物组，其特征在于，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP四种反应引物，所述四种反应引物依为：

正向外引物F3： 5'- GTCGTCTCCAGATGTGAAT -3 '；

反向外引物B3： 5'- CAGACCATACCTAGGCATAT -3 '；

正向内引物FIP： 5'- GGCATTTTCAACTATGGGTTTAAGTTGTTTGGGTTATGATGGATGG -3 '；

反向内引物BIP： 5'- AAGCCAACTCTGAGACAAATCATATGGTCCTTCA GCATTCC -3 '。

2.一种包含权利要求1所述快速检测紫藤脉花叶病毒的LAMP引物组的检测紫藤脉花叶病毒的LAMP检测试剂盒。

3. 根据权利要求2所述的检测紫藤脉花叶病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，含有LAMP检测优化体系，该LAMP检测体系包括：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、LAMP反应基础液（10×Thermopobuffer，8 U Bst DNA聚合酶，dNTPs，Betain和 MgCl₂ ），其中，内引物与外引物的浓度比为4:1，内引物包括正向内引物FIP、反向内引物BIP，外引物包括正向外引物F3、反向外引物B3。

4. 根据权利要求3所述的检测紫藤脉花叶病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，LAMP检测体系中各主成分终浓度为：正向内引物FIP和反向内引物BIP 0.8 μM、正向外引物F3和反向外引物B3 0.2 μM，8 U Bst DNA聚合酶0.32 U/μL，dNTPs 1.0 mM，Betain 0.8 M，MgCl₂ 1.6 mM。

5.根据权利要求4所述LAMP检测试剂盒进行快速检测紫藤脉花叶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.粗提待测样品RNA，利用反转录试剂盒进行逆转录，获得cDNA；

S2.以S1所获得的cDNA为模板，LAMP引物组进行LAMP扩增反应；

S3.根据扩增结果判断待测样品中是否受紫藤脉花叶病毒侵染。

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述LAMP扩增反应的体系为：10×Thermopobuffer 2.5 μL，8 U Bst DNA聚合酶1 μL，10 mM dNTPs 2.5 μL，3 M Betain2.0 μL，20 mM MgCl₂ 2.0 μL，10 μM外引物FIP/BIP 2.0 μL，10 μM内引物F3/B3 0.5 μL，模板2.5 μL，去离子水补至25 μL。

7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述LAMP扩增反应的条件为：水浴65℃，孵育45 min。

8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S3所述根据扩增结果判断待测样品中是否含受紫藤脉花叶病毒侵染的方法为：利用琼脂糖凝胶电泳检测和荧光染料SYBRGreen I对LAMP扩增产物进行检测，根据检测结果判断待测样品中是否受紫藤脉花叶病毒侵染。

9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳检测结果呈现阶梯式条带，则为阳性结果，表示待测样受到紫藤脉花叶病毒的侵染；若无阶梯式条带，表示待测样未受到紫藤脉花叶病毒的侵染；所述荧光染料法为将染料SYBR Green I加入到LAMP扩增产物中，观察显示的颜色，若呈现荧光绿则为阳性，表示待测样受到紫藤脉花叶病毒的侵染；若为橙色则为阴性，表示待测样未受到紫藤脉花叶病毒的侵染。