[发明专利]一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)2

权利要求书

1.一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法，其特征在于，先采用犬冠状病毒灭活疫苗免疫健康牛，采集血分离高免血清，然后从高免血清中分离纯化IgG，经胃蛋白酶酶切，将酶切产物过亲和层析柱，收集洗脱液，过滤，除菌得犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)₂。

2.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法,其特征在于，所述犬冠状病毒为犬冠状病毒BJ02。

3.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法,其特征在于，所述的犬冠状病毒灭活疫苗的制备方法为：将犬冠状病毒BJ02在MDCK细胞上扩大培养后，以47份的灭活的犬冠状病毒与4份的吐温-80及终浓度为0.3mg/mL胸腺肽制备水相，94份白油与2份硬脂酸铝及6份司本80制备油相，油相与水相混合乳化后制成油乳灭活苗，疫苗中病毒含量≥10⁵TCTD₅₀/0.1mL。

4.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法,其特征在于，所述采用犬冠状病毒灭活疫苗免疫健康牛的免疫程序为：首次以肌肉多点及交会穴注射3-5mL的犬冠状病毒灭活疫苗，进行基础免疫，间隔7天后同样方式注射3-5mL犬冠状病毒灭活疫苗进行第一次加强免疫，第一次加强免疫后间隔7天进行下一次加强免疫，以后每间隔7天进行下一次加强免疫，免疫剂量逐次递增0.5-1mL。

5.根据权利要求4所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法,其特征在于，加强免疫后持续监测犬冠状病毒抗体效价，当效价达到2⁵时开始采血。

6.根据权利要求5所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法,其特征在于，加强免疫后持续监测犬冠状病毒抗体效价，当效价达到最高峰时开始大量采血。

7.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法,其特征在于，分离纯化IgG具体包括以下步骤：

(1)向采集的血液加入200单位/mL的青霉素和100ug/mL链霉素，4℃下静置8-12h后收集血清；

(2)向血清中先后加入2倍体积的0.06M，pH4.2的PBS和1/20体积的正辛酸充分混匀后离心收集上清液；

(3)向所述上清液加入0.227g/mL硫酸铵，放置8-12h后离心收集沉淀；

(4)将沉淀溶解于PBS，再加入硫酸铵至溶液中硫酸铵饱和度为35％，离心再次收集沉淀，最后将沉淀溶解于原血清等体积的PBS中，透析，离心去除沉淀获得IgG。

8.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法,其特征在于，将分离纯化的IgG的pH调整为3-4，加入10-20μg/mg胃蛋白酶，30-37℃消化1-3h后收集酶切溶液进行Protein A+G亲和层析柱纯化，过滤除菌后即为犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)₂。

9.根据权利要求1-8任一所述的方法制备的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)₂。

10.根据权利要求9所述的犬冠状病毒免疫球蛋白F(ab′)₂在制备用于预防和/或治疗犬冠状病毒病药物中的应用。