[发明专利]用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法

说明书

本发明提供一种用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合，包括三组引物和双探针如序列表所示；同时提供一种荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法。本发明采用实时荧光定量PCR Taqman‑MGB探针的方法检测CYP2C9和VKORC1基因多态性，并且采用了野生型与突变型双探针的检测方法，不但提高了特异性，还降低了成本；Taqman‑MGB探针在实验结果的准确性、重复性、特异性、灵敏度等方面均优于普通的探针。因此，本发明建立的CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法存在结果准确、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低廉、快速高效等优点。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合及检测方法。

背景技术

华法林是目前临床上广泛使用的维生素K拮抗剂类口服抗凝血药，用于静脉血栓栓塞、心肌梗死、缺血性脑卒中、心脏瓣膜置换术后、房颤等的抗凝治疗和预防。目前临床使用的华法林制剂是S-华法林和R-华法林的消旋体混合物，其中S-华法林的抗凝活性是R-华法林的2.7～3.8倍，在体内主要由肝脏细胞色素P450 2C9(CYP2C9)进行代谢。CYP2C9基因编码区存在着单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNPs)，其中比较重要的是CYP2C9*2和CYP2C9*3，具有这两种突变的个体所需华法林剂量明显降低，出血的风险也随之增加。另外，维生素K环氧化物环氧化酶复合体1(VKORC1)是体内维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶，华法林可竞争性抑制此酶的作用而达到抗凝效果。因此在临床用药过程中，应首先对患者进行CYP2C9和VKORC1的基因多态性检测，再加上年龄、性别和体重解释约61％的华法林个体用药差异。目前，根据不同基因型和年龄、体重的组合来调节华法林个体化用药的剂量公式已经比较完善。

目前，对于CYP2C9和VKORC1基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、焦磷酸测序法、实时荧光定量PCR(QPCR)、等位基因特异性扩增法(ARMS)等。其中，最常用的测序法能够直接检测突变位点的位置和类型，但该方法操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，且扩增产物容易产生污染。

发明内容

为了解决上述缺陷，本发明的技术目的是提供用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合及检测方法，该方法运用引物与双探针组合的检测方法，具有结果准确、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低廉、快速高效等优点。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：一种用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合，包括三组引物和双探针，其中：第一组引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.1所示，下游引物由SEQ ID NO.2所示，荧光探针1由SEQ ID NO.3所示，荧光探针2由SEQ ID NO.4所示；第二组引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.5所示，下游引物由SEQ ID NO.6所示，荧光探针1由SEQ ID NO.7所示，荧光探针2由SEQ ID NO.8所示；第三组引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.9所示，下游引物由SEQ ID NO.10所示，荧光探针1由SEQ ID NO.11所示，荧光探针2由SEQ IDNO.12所示。