[发明专利]适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法

权利要求书

1.适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1、制备芸香科植物SRNase1或SRNase2的体外重组蛋白样品；

步骤S2、制备电泳所需要的SDS-PAGE/琼脂糖凝胶和反应液；

步骤S3、将体外重组蛋白样品与反应液在合适的条件下反应并电泳；

步骤S4、电泳后，进行照胶，观察凝胶上的条带，在SDS-PAGE胶上，若在样品蛋白对应显示列上有不同于背景颜色的白色条带，说明样品具有核糖核酸酶活性；在琼脂糖凝胶上，若阴性对照列上有不同于背景颜色的白色条带，且随着重组蛋白的添加量增加，相应蛋白对应显示列上条带亮度越来越弱，则说明样品具有核糖核酸酶活性。

2.根据权利要求1所述的适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法，其特征在于，所述步骤S2中的SDS-PAGE胶为1mm，10孔的15％的SDS-PAGE胶；所述琼脂糖凝胶为1％浓度并用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶。

3.根据权利要求1所述的适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法，其特征在于，所述步骤S2中制备反应液的方法包括：

步骤21a、将体外重组蛋白样品从-10～30°的低温环境中取出，吸取60ug的蛋白样品；

步骤22a、用PBS将蛋白样品补足至15ul；

步骤23a、向蛋白样品中加入2-4ul的5xloading，吸打混匀，得到反应液a。

4.根据权利要求1所述的适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法，其特征在于，所述步骤S2中制备反应液的方法包括：

步骤21b、吸取10ug的体外重组蛋白和称量1-3ug的花柱RNA；

步骤22b、用DEPC水将体外重组蛋白和花柱RNA的混合溶液补足至20ul，得到反应液b。

5.根据权利要求1所述的适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法，其特征在于，所述步骤S3包括以下步骤：

步骤31a、将反应液a和蛋白marker点在SDS-PAGE胶上；

步骤32a、将SDS-PAGE胶放入电泳仪电泳，电压为110V,电泳时间为60-80分钟，电泳后，得到蛋白胶；

步骤33a、切去蛋白胶的上层浓缩胶，得到下层分离胶，漂洗下层分离胶；

步骤34a、将漂洗好的下层分离胶放入孵育液中，并放入摇床孵育一小时，孵育温度为35-40摄氏度；

步骤35a、孵育后，用0.005-0.015Mol/L的Tris-HCl溶液漂洗下层分离胶8-12分钟，再用染色液给下层分离胶染色8-12min；

步骤36a、用0.005-0.015Mol/L的Tris-HCl在摇床上漂洗下层分离胶，直到看见白色条带。

6.根据权利要求5所述的适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法，其特征在于，所述步骤33a中漂洗下层分离胶的方法包括：

步骤33a1、用洗涤液浸没下层分离胶，并放置在温室的摇床上，每次漂洗8-12分钟，漂洗5-7次；

步骤33a2、用0.005-0.015Mol/L的Tris-HCl溶液洗去下层分离胶中的异丙醇，每次漂洗8-12分钟，漂洗5-7次。

7.根据权利要求6所述的适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法，其特征在于，所述步骤33a1中的洗涤液包括：0.005-0.015Mol/L的Tris-HCl溶液70-80ml和异丙醇20-30ml。

8.根据权利要求5所述的适用于芸香科植物体外鉴定RNase核糖核酸酶活性的方法，其特征在于，所述步骤34a的孵育液包括：0.05-0.15Mol/L的Tris-HCl溶液40-50ml、YeastRNA 0.1-0.15g和EDTA₂Na 3-3.5g。