[发明专利]一种甘蔗黄叶病毒运动蛋白表达纯化方法及其多克隆抗血清的制备

说明书

本发明涉及一种甘蔗黄叶病毒运动蛋白(ScYLV‑MP)表达纯化方法以及ScYLV‑MP多克隆抗血清的制备和检测试剂盒的构建，其中ScYLV‑MP表达纯化步骤为：(1)ScYLV‑MP基因的调取及扩增：(2)ScYLV‑MP基因原核表达载体构建；(3)His‑tag‑(ScYLV‑MP)融合蛋白的原核表达；(4)His‑tag‑(ScYLV‑MP)融合蛋白的纯化；(5)ScYLV‑MP蛋白的获得。采用本发明所述方法获得的ScYLV‑MP蛋白多克隆抗血清不仅准确率高、灵敏度高，而且特异性好，可实现甘蔗黄叶病毒及其运动蛋白的准确检测，具有较大的应用价值和市场前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测甘蔗黄叶病毒及其运动蛋白的血清学方法及其专用表达纯化方法及其多克隆抗血清的制备。

背景技术

甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV)是侵染甘蔗的重要病毒，属于黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)。该病毒具有韧皮部局限的特点，主要通过蚜虫持久循回型和非增殖方式传播。ScYLV侵染造成的损失主要是感病植株叶片黄化并生长减缓，最大减产可达50％。甘蔗作为我国主要糖料作物，其产生的蔗糖占我国食糖产量的90％以上，同时可生产乙醇，为新能源产业发展作出贡献。近年来，甘蔗黄叶病毒引起的病害在我国主要甘蔗产区普遍发生，造成严重减产，从而对我国经济发展、能源产业发展等多领域构成威胁。

ScYLV为正义单链RNA(+ssRNA)病毒，具有正二十面体球形病毒粒子，直径约为25-30nm，由180个蛋白亚基按T＝3形成，包裹着基因组RNA，无包膜。ScYLV基因组全长约5.9kb，共含有6个开放阅读框(ORFs)，编码6个蛋白，前三个ORF通过基因组RNA表达，后三个通过亚基因组RNA表达，其中ORF4编码甘蔗黄叶病毒运动蛋白(简称ScYLV-MP蛋白)，可定位在胞间连丝，在病毒复制和移动过程中发挥重要调节作用。

目前对于ScYLV的检测，主要利用RT-PCR技术，据报道血清学技术主要利用ScYLV外壳蛋白制备的抗血清通过Western blot或ELISA进行检测，然而利用运动蛋白制备抗血清检测ScYLV尚未见正式报道。

发明内容

本发明首先提供一种甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV)运动蛋白(ScYLV-MP)表达纯化方法，具体步骤为：

(1)ScYLV-MP基因的调取及扩增；

(2)ScYLV-MP基因原核表达载体构建；

(3)His-tag-(ScYLV-MP)融合蛋白的原核表达；

(4)His-tag-(ScYLV-MP)融合蛋白的纯化。

其中，所述ScYLV-MP基因的调取及扩增是以含有ScYLV运动蛋白基因全长的克隆质粒为模板，以5'-CATATGTCAGAAGACGCGCTAACCGT-3'(下划线为限制性内切酶Nde I的识别位点)和5'-CTCGAGTAAAGTCTTTCCCCCTG-3'(下划线为限制性内切酶XhoI的识别位点)为引物进行PCR扩增；

其中，所述ScYLV-MP基因原核表达载体构建是将步骤(1)中得到的PCR扩增产物和克隆载体pMD19-T进行连接，得到重组质粒pMD19-T-ScYLV-MP，用限制性内切酶Nde I和XhoI进行酶切，回收酶切片段，取载体pDB.His.MBP，用限制性内切酶Nde I和Xho I进行酶切，回收载体骨架，将所述酶切片段和所述载体骨架进行连接，得到重组质粒pDB.His.MBP-ScYLV-MP；