[发明专利]一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法

说明书

一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法，属于微生物领域。所述方法包括：（1）利用梯度稀释法从样品根际土壤中分离获得细菌菌株；（2）使用划线纯化方法对分离获得的菌株进行纯化，获得细菌纯培养；（3）筛选，利用改良的牛津杯法筛选拮抗细菌，特点在于使用的是半固体培养基和改良的牛津杯法，进行拮抗细菌的筛选。植物根际土壤微生物种类丰富，而细菌间则可能存在相互拮抗现象，本发明则利用快速简便的方法将可能存在的拮抗细菌筛选出来。相较现行的其他方法，操作更为简单，效果更为显著。

技术领域

本发明属于微生物生态学领域，更加具体的讲，是涉及一种快速有效的筛选植物根际土壤中拮抗细菌的方法。

背景技术

众所周知，植物根际土壤是一个微生物种群极其丰富的环境，而不同的微生物之间可能存在多种相互作用，如拮抗，寄生，共生。

研究这种拮抗现象的意义在于：首先它可以提供最直接的实验证据，证明同一生境下细菌之间确实存在拮抗作用，对微生物群落中细菌之间相互作用的研究有重要意义；其次可以应用此方法筛选对植物致病菌有抑制作用的细菌，进而可以将这些拮抗细菌应用于农业领域。那么，这就需要一种快速简便的筛选拮抗菌株的方法。

目前有很多学者致力于各种抑菌现象的研究，但大多集中在真菌与真菌之间，或者真菌与细菌、放线菌之间的拮抗，对细菌之间的相互拮抗研究较少。有研究者使用传统的牛津杯法研究了一种侧孢短芽孢杆菌 S62-9 对常见微生物的抑菌作用（张丹等，中国食品学报，2017，17（1）：55-61.），陈志谊等利用涂布法和滤纸片法对多个菌株混合的植物病原菌生防制剂中拮抗细菌菌株之间的互作关系及其对生物防治效果的影响进行研究（陈志谊等，植物病理学报，2005，35（6）：539-544.），但这些研究多是采用传统的牛津杯法测定上清液的抑菌活性，亦或使用传统的涂布平板法，或用滤纸片蘸取拮抗菌贴到平板上。这些方法都有一些缺陷，如传统的牛津杯法使用除去菌体的上清液测定抑菌活性，这样存在指示菌和拮抗菌之间无直接接触，抗菌物质无法连续产生等问题；而涂布平板法，指示菌涂布的不均匀会导致抑菌现象不清楚；若使用滤纸片，则会稀释拮抗菌液导致真实活菌数无法确定，而且容易污染杂菌。此类方法都普遍存在操作繁琐，工作量大，效果不佳等诸多问题。另外这些细菌是从不同环境中取得的，对同一生境下如植物根际土壤这种微生物种类丰富的环境中的细菌间的相互拮抗作用的研究鲜有报道，对其可能存在的诱导拮抗现象的研究也少之又少。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于针对传统牛津杯法操作繁琐、效率低的问题，提出一种高效筛选植物根际土壤中拮抗细菌的方法。本方法用单层半固体平板代替了双层平板，并且在牛津杯中加入了过夜培养的细菌菌液和新鲜培养基，无需过滤除菌步骤，使得操作更加简单。另外，细菌在牛津杯中生长，可以同步产生抑菌物质，提高了抑菌物质的含量，使得其筛选效率提高。

本发明采取的技术措施如下：一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法，包括植物根际土壤样品中细菌分离、纯化和拮抗细菌筛选；

所述植物根际土壤样品中细菌的分离包括下述步骤：

1、样品土壤的处理：采集根际土壤后，加无菌水振荡处理获得菌悬液；

2、稀释液涂布平板：将菌悬液进行10倍梯度稀释（10^-1,10^-2,10^-3，10^-4,10^-5），获得稀释液，将不同梯度的稀释液分别涂布于R2A固体培养基，然后将平板移入28℃恒温培养箱培养；

所述R2A固体培养基：酵母浸出粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，酪蛋白水解物0.5 g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氢二钾0.3 g，无水硫酸镁0.024 g，丙酮酸钠0.3 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 ml，PH=7.4。