[发明专利]一种提高超慢生花生根瘤菌中转座子转座效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高超慢生花生根瘤菌中转座子转座效率的方法。实验证明，采用常规根瘤菌三亲杂交方法向花生慢生根瘤菌CCBAU 53363中插入Tn5转座子的Tn5转座效率为1.25％，采用本发明建立的方法向花生慢生根瘤菌CCBAU 53363中插入Tn5转座子的Tn5转座效率为18.75％‑18.8％。与常规根瘤菌三亲本杂交方法相比，本发明建立的方法向花生慢生根瘤菌CCBAU 53363中插入Tn5转座子，Tn5转座效率提高了近15倍。本发明对超慢生花生根瘤菌的转座子遗传操作非常有效，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高超慢生花生根瘤菌中转座子转座效率的方法。

背景技术

根瘤菌是一类广泛分布在土壤中的革兰氏阴性细菌，它能够侵染豆科植物并形成根瘤，在根瘤中分化形成成熟的能够固定空气中氮气的类菌体，将氮气转化成能够被植物吸收利用的氨，同时植物提供给根瘤菌生活所需的碳源。因此，豆科植物和根瘤菌是一种互惠互利的共生关系，据统计由这种共生关系固定的氮素占所有生物固氮总量的65％以上。根瘤菌与豆科植物的共生在提高土壤肥力、降低氮肥的施用量上具有巨大的潜力。

根瘤菌主要分为根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)等。其中，慢生根瘤菌适应性强，宿主来源广，是很多重要豆科作物(如大豆、花生等)的主要共生菌群，因此慢生根瘤菌的研究具有重要的理论和应用价值。但由于慢生根瘤菌缓慢的生长速度，导致对慢生根瘤菌的遗传研究比快生根瘤菌困难得多，这就阻碍了人们对慢生根瘤菌与豆科植物之间共生机理的认识。花生慢生根瘤菌属于超慢生根瘤菌(代时达到15h甚至更长)。目前，对花生慢生根瘤菌共生特性的研究和认知更少。采用大豆慢生根瘤菌的遗传操作方法在花生慢生根瘤菌上难于获得成功，可能与花生慢生根瘤菌比大豆慢生根瘤菌生长更慢有关。因此，探索超慢生根瘤菌的遗传操作方法对于研究超慢生根瘤菌的共生机制十分必要。

转座子(transposon，Tn)是能在基因组间或组内跳跃的DNA片段。转座子种类较多，其中Tn5转座子能产生单一位点、无泄漏的极性突变，且插入突变效率高，该技术被广泛应用于发现新基因以及分析基因功能等研究方面。

pRL1063a质粒包括两部分，分别为Tn5转座子基因和含有EcoRI酶切位点的外部基因。正常情况下，由于pRL1063a质粒属于自杀型质粒不能在受体菌中进行自我复制，Tn5转座子基因只能通过插入到受体菌基因组上才能够随着受体菌基因组的复制而复制。采用常规的三亲本杂交条件时，pRL1063a质粒中的Tn5转座子在快生根瘤菌、中慢生根瘤菌或部分慢生根瘤菌基因组上的转座效率能达到100％，而pRL1063a质粒中的Tn5转座子在花生慢生根瘤菌CCBAU 53363基因组上的转座效率却低得多。由此可见，常用的三亲本杂交条件并不适合花生慢生根瘤菌。因此，寻找适合的转座子以及筛选出最优的三亲本杂交条件是研究花生慢生根瘤菌基因功能的前提，并且对其它超慢生根瘤菌的研究有借鉴意义。

sacB基因为蔗糖敏感基因，最早来源于Bacillus subtilis，其编码分泌型蔗糖果聚糖酶，该酶催化蔗糖水解和形成高分子量的果聚糖聚合物—左旋聚糖。由于左旋聚糖具有较高的分子质量，在细胞周质空间上会进行积累，同时果糖残基会与细胞上多种受体结合，这些都阻碍了细胞正常的物质交换，对细胞具有潜在毒害作用，进而造成细胞的死亡。当蔗糖的浓度在5％以上时，sacB基因的表达对于细胞来说是致命的。基于这种特性，sacB基因在遗传上被作为一种阴性筛选克隆的标记应用于生物学的研究中(吴菁，刘秀敏，张维，陈明，林敏.枯草芽孢杆菌sacB基因的功能验证及应用.核农学报，2008,5,590-05.)。

发明内容

本发明的目的为提高超慢生花生根瘤菌中转座子转座效率。

本发明首先保护一种将Tn5转座子插入超慢生根瘤菌基因组的方法，可包括如下步骤：