[发明专利]一种基因敲除选育Lgr6基因缺失型斑马鱼的方法

权利要求书

1.一种基因敲除选育Lgr6基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）分别设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物

在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查询斑马鱼Lgr6基因的基因组DNA序列，在网站SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计Lgr6基因的靶位点；

两对特异性靶位点PCR 引物如下：

F1（靶位点a正向引物）：

tgTAATACGACTCACTATAgggtcctgtgcccattctcaGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

F2（靶位点b正向引物）：

tgTAATACGACTCACTATAggtcagatcagttggcacgcGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

R（共用的反向引物）：AAGCACCGACTCGGTGCCACT

PCR 检测引物

PCR检测引物上下游引物都位于1号外显子上：

F (5’-AGGCACATACACACAGACAAAC-3’)

R (5’-ATCAAAGTGGATGACAGAAGCG-3’)；

2）构建gRNA表达载体以及特异性gRNA体外合成

a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上；

b，特异性gRNA体外合成

用BsaI限制性内切酶线性化此质粒；酶切反应总体积为20 μL，体系如下：

p42250载体 2 μL

10× Buffer 2 μL

Bsa I限制性内切酶 1.5 μL

ddH2O 14.5 μL

总体积 20 μL

混匀后于37 ℃水浴，酶切4 h以上；

c,以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA；

正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子20pb靶序列20bp sgRNA上游骨架，反向引物R：20 bp sgRNA下游骨架，

PCR反应体系（50μL）如下：

ddH2O 18 μL

10× Buffer（含20 mM Mg2+） 25 μL

dNTPs（10 mM） 1 μL

Primer F1（或F2，10 uM） 2 μL

Primer R（10 uM） 2 μL

模板（p42250载体） 1 μL

Ex-Taq DNA聚合酶 1 μL

总体积 50 μL

震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应

待反应结束后，离心PCR产物，取1 μL样品点样于1.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果；

d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；

e，测定纯化的DNA浓度，再以此DNA为模板，用20 μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA；具体操作如下：

体外转录反应体系：

模板DNA 12 μL

10×Buffer 2 μL

rATP（10 mM） 1 μL

rUTP（10 mM） 1 μL

rCTP（10 mM） 1 μL

rGTP（10 mM） 1 μL

T7 RNA聚合酶 2 μL

总体积 20 μL

将反应物全部加入1.5 mL RNase-Free 的EP管中，混匀之后，于37 ℃水浴2.5 h,向转录体系中加入1 μL DNA酶，放置于37 ℃水浴锅中反应30min，以消化DNA模板，然后取1 μL的gRNA样品，进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；；

f，特异性gRNA的纯化

用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20 ℃；进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度；

3）斑马鱼胚胎的显微注射

在受精后30 min 之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，

在进行显微注射之前，将Cas9 mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9 mRNA的终浓度为5 ng/μL，gRNA 的终浓度为30-40 ng/μL，注射约1.8 nL Cas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内；注射过的受精卵放置于E3水中，28 ℃孵化；在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；

显微注射体系如下：

Cas9 mRNA 5 ng/μL

gRNA 30-40 ng/μL

Nuclease free H2O

Total 3μL；

4）Sanger测序检测靶位点的有效性

对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其Lgr6基因是否存在突变；

a,提取斑马鱼基因组

斑马鱼胚胎受精60小时后（60 hpf），分别收集野生型和注射后胚胎于1.5 mL Ep管中，每管10-15颗胚胎，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：

向装有胚胎的Ep管中加入200 μL细胞裂解液，2 μL蛋白酶K，放置于55 ℃恒温箱中裂解过夜；

裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积预先冷却的异丙醇于Ep管中，充分颠倒混匀，于4 ℃条件下，12000×g离心10 min，倒掉上清液；

加入75 %乙醇500 μL，于4 ℃条件下，12000×g离心5 min，弃上清液，室温风干8-10min；

加入60 μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率；

b，PCR扩增目的序列

提取基因组DNA后，根据CRISPR靶位点上下游约100-250 bp的基因组区域，利用PrimerPremier 5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段；

PCR反应体系如下：

2×Es Taq MasterMix 10 μL

Primer F (10 μM) 0.6 μL

Primer R (10 μM) 0.6 μL

模板(基因组DNA) 1 μL

ddH2O 7.8 μL

总体积 20 μL

震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；

PCR结果进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息；

c,注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤；

5）获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代

通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28 ℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10-15个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出326 bp的靶位点附近区域，观察PCR扩增是否会出现小带，如果此突变可以遗传到F1代，则PCR扩增会出现小于326 bp的小带；如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体。