[发明专利]一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法

说明书

本发明公开了一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，以PCV2毒株基因组为参考序列，在PCV2b的Cap蛋白编码基因上游偶联SUMO促溶表达标签编码基因，在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，优化基因，重组至PUC57质粒，以重组质粒为模板，设计特异性引物，经PCR扩增后产物克隆入pMAL‑C4x原核表达载体，构建重组质粒，转入大肠杆菌进行诱导、纯化。本发明成功构建了pMAL‑MBP‑HisSUMO‑Cap重组表达载体，MBP‑HisSUMO‑Cap融合蛋白在BL21(DE3)中可实现可溶性表达，纯化后MBP‑HisSUMO‑Cap融合蛋白作为免疫原，能与PCV2b阳性猪血清、兔抗MBP‑tag多克隆抗体和免疫小鼠抗血清均能发生特异性反应，表明其具有较好的免疫原性，为PCV2b诊断试剂盒的研发奠定了理论基础。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2，PCV2)属于无囊膜、单股、环状、负链DNA病毒，是已知最小的动物病毒之一，是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、皮炎和肾病综合征(PNDS)的主要病原。临床特征常为坏死性淋巴结炎、急性肺水肿、生殖障碍和肉芽肿性肠炎。在临床案例中，PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)、古典猪瘟(Classical swine fever virus，CSFV)、链球菌(Streptococcus)和大肠杆菌(Escherichia coli)等病原混合感染，严重制约着全球养猪业的持续健康发展。PCV主要分为三个基因型，即PCV1、PCV2和PCV3，PCV2作为该PCV家族中重要的基因型，包括PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e基因亚型，其中PCV2b是我国猪群中主要流行的基因亚型。在临床病例中常出现PCV2b和PCV2a亚型的共同感染，促进PCV2b和PCV2a亚型间的基因组同源重组，有利于在病毒进化过程中发挥重要作用。

PCV2粒子呈球形，直径大小约12～23nm，基因组大小约为1760bp，含有11个开放阅读框(ORFs)，其中ORF1、ORF5、ORF7和ORF10位于病毒基因组正链，其他ORFs则位于基因组互补链。ORF1和ORF2为两个主要的ORF，ORF1编码病毒复制蛋白，即Rep蛋白。ORF2编码病毒结构蛋白，即Cap蛋白，由233～234个氨基酸组成，分子量大小约278000。Cap蛋白作为一种免疫相关性蛋白，在病毒入侵宿主细胞和复制过程中起重要作用。有学者发现，PCV2通过Cap蛋白与宿主细胞表面的特异性受体结合，由网格蛋白介导的内吞途径进入宿主细胞。因此，Cap蛋白常作为PCV2分子病原学、致病机理和诊断技术等研究的靶蛋白。国内、外学者先后采用真核、杆状病毒表达系统等表达Cap蛋白，为Cap蛋白的研究奠定坚实的基础，而大肠杆菌具有生长速度快、培养经济快捷、表达水平高、待选质粒和宿主多等特点，是常用的蛋白表达系统，但是外源蛋白在大肠杆菌中高水平表达的同时，易被宿主蛋白酶降解或形成包涵体。因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景。

发明内容

针对上述背景技术中指出的不足，本发明提供了一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，旨在解决上述背景技术中现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，该方法包括以下步骤：

(1)引物设计与合成