[发明专利]一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.以埃德菌FS110基因组DNA为模板，以引物5SrRNA-promoter-F、5SrRNA-promoter-R作为引物进行PCR扩增，得到含有一个BglII酶切位点的5SrRNA启动子的片段1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

b.以人工合成sgRNA序列及其终止子序列为模板，以引物5SrRNA-sgRNA-F、sgRNA-Terminator-R作为引物进行PCR扩增，得到含有一个PacI酶切位点、sgRNA及其终止子的片段2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

c.将步骤a得到的片段1和步骤b得到的片段2混合作为模板，进行融合PCR，得到5SrRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子片段；

d.对pFC332质粒、步骤c得到的5SrRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子片段分别进行PacI和BglII双酶切，酶切后的片段用T4 DNA连接酶进行连接，得到适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA。

2.一种根据权利要求1所述的构建方法构建得到的适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA。

3.一种含有权利要求2所述的适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA的真菌。

4.权利要求2所述的适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体pFC332-sgRNA在真菌基因敲除中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的真菌为埃德菌FS110或埃德菌FS140。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

a.在待敲除的基因中寻找靶向位点，对应设计靶向引物并退火形成双链，将其酶切连接至载体pFC332-sgRNA中，得到的靶向敲除重组载体；

b.将靶向敲除重组载体通过原生质体介导法导入埃德菌FS110原生质体，用潮霉素抗性PDA平板筛选，挑取阳性克隆基因组DNA验证重组载体的导入，并通过Cruiser Enzyme切割和测序验证目标基因的敲除。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，为靶向敲除胶霉毒素生物合成基因GliG，包括以下步骤：

针对基因GliG设计靶向引物为gliG-F1和gliG-R1，利用T4 PNK酶进行磷酸化并退火反应形成gliG-F1/gliG-R1双链；所述的gliG-F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的gliG-R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

以构建的载体pFC332-sgRNA为模板，以引物BglII-F、PacI-R作为引物进行PCR扩增，然后对该PCR产物和gliG-F1/gliG-R1双链进行BglII和PacI双酶切，酶切产物胶回收，利用T4Ligase连接转化，构建得到G1-pFC332-sgRNA质粒即为靶向敲除胶霉毒素生物合成基因GliG的重组载体。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，为靶向敲除胶霉毒素生物合成基因GliO，包括以下步骤：

针对基因GliO设计靶向引物为gliO-F1和gliO-R1，利用T4 PNK酶进行磷酸化并退火反应形成gliO-F1/gliO-R1双链；所述的gliO-F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的gliO-R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

以构建的载体pFC332-sgRNA为模板，以引物BglII-F、PacI-R作为引物进行PCR扩增，然后对该PCR产物和gliO-F1/gliO-R1双链进行BglII和PacI双酶切，酶切产物胶回收，利用T4Ligase连接转化，构建得到O1-pFC332-sgRNA质粒即为靶向敲除胶霉毒素生物合成基因GliO的重组载体。