[发明专利]一种褐藻胶裂解酶及其在褐藻胶定量检测中的应用

说明书

本发明涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种褐藻胶裂解酶及其在褐藻胶定量检测中的应用。褐藻胶裂解酶Aly7A具有新颖的氨基酸序列及良好的酶学性质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。以Aly7A为基础，本发明建立了一种褐藻胶的定量检测方法：将褐藻胶裂解酶Aly7A与待测样品进行混合反应，使样品中可能含有的褐藻胶发生酶解，检测反应体系在235nm处的吸光值增量并代入标准曲线，即可测得待测样品中褐藻胶的含量，该检测方法具有特异性强、快速、简便等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种褐藻胶裂解酶及其在褐藻胶定量检测中的应用。

背景技术

褐藻胶是一类重要的线性高分子海洋多糖，由α-L-古洛糖醛酸与β-D-甘露糖醛酸通过β-1,4糖苷键连接而成，主要存在于海带、马尾藻等大型褐藻中，常见产品形式包括海藻酸钠、海藻酸钾和海藻酸钙等，因具有良好的凝胶性、可塑性，作为食品添加剂被广泛的应用于冰激凌、面包、果冻、啤酒、挂面等食品的工业生产中。褐藻胶是可溶性膳食纤维，多项研究表明褐藻胶可促进肠胃蠕动、改善肠道菌群并具有降血脂、促生长等生理活性，展现出褐藻胶在功能食品开发方面的应用潜力。

褐藻胶的定量检测是褐藻胶质量控制、功能研究、产品开发中的基础环节。目前，常用的褐藻胶定量检测方法包括硫酸-咔唑法、高效液相色谱法等。硫酸-咔唑法测定褐藻胶的原理是通过测定糖醛酸含量计算出褐藻胶含量，该方法操作简便，但除褐藻胶外，硫酸-咔唑法对果胶、阿拉伯胶等含糖醛酸多糖也显色，方法特异性差。高效液相色谱法通过对样品进行水解、衍生及预处理，通过测定褐藻胶组成单糖即α-L-古洛糖醛酸与β-D-甘露糖醛酸的含量合计得到褐藻胶含量，该方法灵敏度高、准确性好，但仪器成本高、操作繁琐。

褐藻胶裂解酶是一类降解褐藻胶的裂解酶，国内外目前已有多项利用褐藻胶裂解酶制备褐藻胶降解产物及(或)寡糖的专利。褐藻胶裂解酶通过β-消除反应催化褐藻胶分子内1,4糖苷键的断裂，在非还原性末端糖残基的C4与C5间新形成共轭双键，该共轭双键在235nm处有特征吸收峰。但其转化褐藻胶的完全性、特异性将决定了其能否作为有效反应物来应用于褐藻胶的定量检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现在常用的褐藻胶定量检测方法存在对果胶、阿拉伯胶等含糖醛酸多糖也显色、方法特异性差，或成本高、操作繁琐的问题，而褐藻胶裂解酶转化褐藻胶的完全性、特异性将决定了其能否作为有效反应物来应用于褐藻胶的定量检测。

为解决上述问题，本发明提供了一种新型的褐藻胶裂解酶Aly7A，该酶与其他已知酶的序列相似度最高仅为61％(最相近序列为Flavobacterium sp.UMI-01所产的FlAlyA)。褐藻胶裂解酶Aly7A对于聚古洛糖醛酸嵌段的均聚物、聚甘露糖醛酸嵌段的均聚物以及古洛糖醛酸与甘露糖醛酸随机交替形成的片段均具有高活力，可完全地将褐藻胶转化为二糖至六糖，但对于其他含有糖醛酸的底物，如果胶、阿拉伯胶等均无降解作用；将该酶与不同浓度褐藻胶溶液混合反应，发现反应前后反应体系在235nm处吸光值增量与褐藻胶浓度呈现理想的线性关系，依据上述发现，本发明基于Aly7A建立了一种褐藻胶的定量检测方法，与传统方法相比具有特异、快速、简便等优点。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：一种褐藻胶裂解酶，为褐藻胶裂解酶Aly7A，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.1：