[发明专利]一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法。本发明通过培养基、培养方法等的改进降低了农杆菌侵染液的浓度，减轻了辣椒子叶的超敏反应，有利于后续的再生过程；菌体浸染液中不添加乙酰丁香酮Acetosyringone(AS)，子叶和农杆菌固体MS共培养培养基中添加乙酰丁香酮(AS)和二硫苏糖醇Dithiothreitol(DTT)可显著促进转化效率的提高。本发明对部分基因型进行了转化验证，在大部分基因型中可显著促进转化效率的提高。表明该方法可以用于辣椒转基因和基因编辑研究中的遗传转化，进一步促进辣椒转基因植株的获得。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法。

背景技术

植物基因组修饰自古有之，最早是利用选择育种来实现，随后是诱变育种和转基因育种，现在则是通过基因编辑来修饰目的基因从而达到育种要求。基因编辑的优势在于准确、快速、高效。多种作物中如番茄、玉米、小麦等已利用该技术进行基因功能验证和创制新的种质资源。实施该技术的基础是成熟的转基因技术体系，所以很多植物由于没有成熟的转基因技术体系，严重限制了该技术的实施和发展。

辣椒属于转化和再生顽拗型植物，有些基因型获得转基因植株的概率在0.01％～0.05％，但是大部分基因型难以获得转基因植株。转化作为转基因技术体系的第一步，其效率的高低决定了后续过程中是否能够获得转基因植株。植物遗传转化的方法包括根癌农杆菌介导法、基因枪转化法及花粉管通道法、蘸花法等其他方法，由于根癌农杆菌介导法简单易行、经济高效，使用最为广泛。

辣椒上多是通过根癌农杆菌介导法获得转基因植株，但是由于辣椒转化和再生具有很强的基因型依赖性导致很难建立通用的转化再生技术体系。目前文献报道的辣椒遗传转化体系为：苗龄为10-14d的幼苗子叶作为转化外植体，在预培养基中预培养2d，然后OD值为0.3～0.8的菌液悬浮液(MS液体培养基+AS 20mg/L)侵染子叶外植体8-20分钟，灭菌的滤纸吸干子叶上的残留菌液，子叶置于共培养培养基上培养3d，完成农杆菌介导的遗传转化。通过试验，我们发现利用该体系进行遗传转化，大部分基因型的转化效率很低。通过调整菌液浓度、预培养时间、共培养时间等常规试验参数无法显著提高侵染效率。针对以上转化体系效率低的问题，优化和改良辣椒转化方法提高转化效率势在必行。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法，包含以下步骤：

(1)消毒后的辣椒种子播种于含蔗糖的固体MS培养基，取苗龄14d的幼苗子叶作为外植体，用于农杆菌介导的遗传转化；其中，所述的固体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4～5g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L；

(2)将含有卡那霉素和利福平抗性标记的目的基因的载体转化根癌农杆菌EHA105，25℃～28℃条件下培养待长出明显的菌落，挑取阳性单克隆菌落，接种在包含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，振荡培养至OD 600＝0.8～1.2，取上述菌液加入包含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，振荡培养至OD 600＝0.5～0.8；

(3)将菌液在4℃，6000rpm条件下离心5min，用液体MS培养基重悬浮菌体并清洗，再次用液体MS培养基重悬菌体，调整菌体侵染液的最终浓度为OD 600＝0.08-0.12；所述的液体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4～5g/L+蔗糖30g/L，pH5.8；

(4)将子叶外植体在菌体侵染液中浸染15分钟，取出置于灭菌后的滤纸上吸干残留菌液，将子叶背面朝下整齐排布于共培养培养基中,，共培养3d，完成目的基因的遗传转化过程；所述的共培养培养基配方为含维生素的MS基础培养基4～5g/L+蔗糖30g/L+AS 15～20mg/L+DTT100～150mg/L+琼脂粉8g/L。