[发明专利]一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用，本发明的粪便脱落细胞核酸保存试剂包括非离子表面活性剂，阴离子表面活性剂，渗透压调节剂，细胞膜稳定剂，螯合剂，pH缓冲液和水，还含有除臭剂。本发明的保存试剂可以有效裂解粪便中的人体脱落细胞，且不含有硫氰酸胍和异硫氰酸胍等有毒成分，从而提供一种从粪便上清中直接进行粪便基因组提取和检测的方法，可以有效避免粪便杂质的干扰，检测前无需再次对粪便样品进行沉淀处理。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用。

背景技术

人体每天会有一定量的脱落细胞进入到粪便中，研究表明，这些脱落细胞中含有癌变信号，因此粪便样本是对某些癌症如消化道癌症进行无创检测的理想样本，在未来的癌症检测领域具有很大的应用前景，美国Exact sciences公司在2014年便推出了multitarget stool DNA test试剂盒，用于结直肠癌的无创检测。

粪便的成分非常复杂，其中含有动物DNA、植物DNA和种类繁多的细菌DNA，还含有多聚糖、胆盐、腐殖质、胆酸等PCR抑制物，庞杂的背景使得从粪便中特异性地检测脱落细胞DNA面临挑战；另外，粪便中还含有大量的核酸酶如DNA酶、RNA酶等，可导致核酸降解，不利于下游核酸的检测；另一方面，粪便中的蛋白质在细菌的分解下会产生吲哚、粪臭素、硫氰化物等难闻气体，对实验操作人员的心理和身体都会产生不利影响。添加除臭剂可以缓解粪便样品的气味刺激。按照除臭机制可以将消臭剂分类四类，分别为遮蔽消臭类、物理消臭类、化学消臭类和生物消臭类。但由于不同种类的消臭剂，对生物样本的活性具有不可预期的影响，当前临床中粪便检测(如大便常规检测、大便隐血检测等)不进行除臭。因此，有效方便的粪便DNA检测特别依赖上游的粪便DNA保存技术。

现有的粪便保存条件多为低温保存，但考虑到运输和保存的便捷程度、样本的重复利用率等问题，常温保存更能节省成本。目前也有一些常温保存粪便样本的试剂和方法，如在中国专利申请20151067125.8中，其保存试剂的主要作用是维持细胞形态、防止细胞破裂，然而该技术没有去除异味的功效，且需要用细胞沉淀进行下一步的检测，沉淀中的粪便杂质极有可能会对检测产生不利影响。

发明内容

为了改善现有技术存在的问题，本发明提供了一种粪便脱落细胞核酸保存试剂，配制过程安全简便，避免使用有毒试剂，能长期有效保存粪便中的脱落细胞，使其核酸满足临床上疾病检测诊断要求，可直接用于下游检测。

本发明采用如下技术方案：

一种粪便脱落细胞核酸保存试剂，包括非离子表面活性剂，阴离子表面活性剂，渗透压调节剂，细胞膜稳定剂，螯合剂，pH缓冲液和水。

根据本发明，所述非离子表面活性剂在保存试剂中体积浓度为0.1％-1％。所述非离子表面活性剂选自Triton X-100或吐温20。

根据本发明，所述阴离子表面活性剂在保存试剂中质量体积浓度为0.1％-1％，例如0.1％。所述阴离子表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠SDS。

根据本发明，所述渗透压调节剂在保存试剂中摩尔浓度为100mM-200mM。所述渗透压调节剂选自氯化钠。

根据本发明，所述细胞膜稳定剂在保存试剂中质量体积浓度为1％-5％。所述细胞膜稳定剂选自甘露醇。

根据本发明，所述螯合剂选自EDTA，所述保存试剂中EDTA的摩尔浓度为30mM-80mM。

根据本发明，所述pH缓冲液选自Tris-HCl缓冲液，所述保存试剂中Tris的摩尔浓度为30mM-80mM。

根据本发明，所述保存试剂的pH为7.5-8.5。