[发明专利]运用转基因家兔作为生物反应器及转化的方法

说明书

本发明涉及动物生物反应器技术领域，尤其为运用转基因家兔作为生物反应器及转化的方法，包括以下步骤：A、制备乳腺表达构件：将目的基因片段插入质粒载体中，形成重组人凝血因子Ⅷ的乳腺表达构件；B、一次制取；C、二次制取；D、收集与提取：通过人工诱导或自然分泌，收集二次转基因家兔的乳汁，从中提取出优质的重组人凝血因子Ⅷ。本发明通过微注射法和逆转录病毒法，将含有重组人凝血因子Ⅷ的乳腺表达构件依次整合到家兔的胚胎原核中、转基因家兔的卵母细胞中，从而依次获得一次转基因家兔、二次转基因家兔，其中后者的乳汁中可提取出更为优质的重组人凝血因子Ⅷ，从而有效提高了家兔生物反应器对重组人凝血因子Ⅷ的转化效率。

技术领域

本发明涉及动物生物反应器技术领域，具体为运用转基因家兔作为生物反应器及转化的方法。

背景技术

近年来，乳腺生物反应器作为动物生物反应器中的一大类，以其产品活性高、易于纯化、产量高且生产成本低等优点在生物制药方面有着大量应用，例如从转基因家畜乳汁中提取重要的药用蛋白。

其中，针对重组人凝血因子Ⅷ的收集与提取，由于家兔乳汁的转换率最高，成为此类动物生物反应器的首选，但在实际制取和转化过程中，由于常规的基因介导方法(微注射法、精子载体法、逆转录病毒法等)通常存在整合效果波动大、重复性差、移植片段有限等问题，导致单一方法所制取的生物反应器效果较差。

发明内容

本发明的目的在于提供运用转基因家兔作为生物反应器及转化的方法，具备转化效率稳定提高的优点，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：运用转基因家兔作为生物反应器及转化的方法，包括以下步骤：

A、制备乳腺表达构件：将目的基因片段(cDNA)插入质粒载体中，形成重组人凝血因子Ⅷ的乳腺表达构件；

B、一次制取：通过微注射法，将乳腺表达构件直接注射到家兔的胚胎原核中，再将胚胎原核放入FBSB2培养液中，并在恒定环境的培养箱中培养15-20h，然后将分裂成4～8个细胞的家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得一次转基因家兔；

C、二次制取：通过逆转录病毒法，将乳腺表达构件与病毒基因组中的特定基因片段进行替换，再通过顺式元件的调控序列和感染成分重组病毒载体，然后注射到特定时期的转基因家兔卵母细胞中，经过体外受精和筛选，将转基因家兔胚胎移植到受体家兔的子宫内，经过妊娠，获得二次转基因家兔；

D、收集与提取：通过人工诱导或自然分泌，收集二次转基因家兔的乳汁，从中提取出优质的重组人凝血因子Ⅷ。

优选的，所述步骤A中质粒载体为pBC1。

优选的，所述步骤A中乳腺表达构件包括调控元件，且调控元件包括鸡β球蛋白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β-酪蛋白外显子2、β-酪蛋白外显子7，8，9、β-酪蛋白内含子7，8、β-酪蛋白基因组片段。

优选的，所述步骤B中恒定环境为35℃-40℃、5％-7％C0₂。

优选的，所述步骤C中特定基因片段为gag、pol、env等基因。

优选的，所述步骤C中特定时期为第二次减数分裂中期。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

通过微注射法和逆转录病毒法，将含有重组人凝血因子Ⅷ的乳腺表达构件依次整合到家兔的胚胎原核中、转基因家兔的卵母细胞中，从而依次获得一次转基因家兔、二次转基因家兔，其中后者的乳汁中可提取出更为优质的重组人凝血因子Ⅷ，从而有效提高了家兔生物反应器对重组人凝血因子Ⅷ的转化效率。

附图说明

图1为本发明工艺流程图。