[发明专利]一种免疫细胞培养方法及其应用

权利要求书

1.一种免疫细胞培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤a：用止血钳在新生儿端10—15cm处夹闭并剪断脐带，用消毒纱布对脐带进行清洁，然后用碘伏进行消毒；

步骤b：针头从脐静脉中穿过，通过装有抗絮剂的血袋对脐带血进行收集当脐静脉渐渐变成白色，脐血采集完毕；

步骤c：通过葡聚糖泛影葡胺密度梯度离心法对脐血中单个核细胞进行分离；

步骤d：将分离出来的单个核细胞接种到培养瓶中，培养瓶抗体包被，在培养瓶内加入10毫升PBS和1毫升ErbB2抗体（2.4mg/ml），一起孵育1h，再用10毫升PBS沿培养瓶侧壁轻轻洗涤2次，最后把培养基加入已包被ErbB2抗体的培养瓶中，在75平方厘米培养瓶中，加入4毫升PBS9（-）和1毫升ErbB2储备液，细胞悬液混合均匀后分别加入培养瓶中，接种的细胞浓度约1×10的7次方cell/ml，倒置显微镜下观察后，置于37℃，湿度为50％-70％，5％的二氧化碳培养箱中培养；

步骤e：培养36h后，加入小牛血清，加入后终浓度为20ng/ml，再培养48h后，加入500毫升ALys505NK-AC培养基，IL-51000u/ml，新鲜血浆5毫升，再次培养36h后，加入300毫升ALys505NK-AC培养基，IL-51000u/ml，最后培养24h后，收获细胞。

2.根据权利要求1所述的一种免疫细胞培养方法，其特征在于：所述免疫细胞培养方法为在制备免疫细胞产品中的应用。

3.根据权利要求1所述的一种免疫细胞培养方法，其特征在于：所述步骤a中用消毒纱布由断脐端向胎盘方向快速清洁，所述碘伏消毒次数为2次。

4.根据权利要求1所述的一种免疫细胞培养方法，其特征在于：所述步骤b中当脐带血流入血袋的时候缓缓摇动血袋，使脐血与抗凝剂充分混合。

5.根据权利要求1所述的一种免疫细胞培养方法，其特征在于：所述步骤c中葡聚糖泛影葡胺密度梯度离心法对脐血中单个核细胞进行分离的方法包括以下步骤：

步骤1：将340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中可配制成密度合适的分层液；

步骤2：分离时先将分层液置于试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面；

步骤3：水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带，红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底，血小板则因密度小而悬浮于血浆中，与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。