[发明专利]一种检测细胞内基因编辑效率及脱靶的方法

说明书

一种检测细胞内基因编辑效率及脱靶的方法，包括：构建TRAP‑seq序列，其包括从5’端至3’端依次连接的上游接头序列、gRNA序列、gRNA骨架序列、gRNA靶向序列和下游接头序列；使用设计在上游接头序列和下游接头序列上的引物，对TRAP‑seq序列进行PCR扩增得到双链TRAP‑seq序列；将双链TRAP‑seq序列连接到质粒骨架上，得到重组TRAP‑seq序列质粒库；对重组TRAP‑seq序列质粒库进行慢病毒包装，并感染宿主细胞株；从被感染的宿主细胞株中提取细胞基因组，然后使用设计在质粒骨架上的引物扩增细胞基因组获得TRAP‑seq序列，然后测序并分析测序数据得到基因编辑效率及脱靶情况。本发明能高通量检测基因编辑效率及脱靶，只需扩增子测序即可获得所需数据量，避免了全基因组测序带来的资源浪费。

技术领域

本发明涉及基因分析检测技术领域，尤其涉及一种检测细胞内基因编辑效率及脱靶的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是一种简单高效的基因编辑工具。其由两部分组成，引导RNA(guide RNA，gRNA)和Cas9蛋白。引导gRNA可指导Cas9蛋白结合到目的基因片段发挥核酸内切酶的作用对靶片段(DNA双链)进行剪切造成双链断裂(double strandbreak，DSB)，机体在对损伤的DNA区域进行修复时会随机引入碱基突变，有一定的概率造成基因突变；如果在修复时另外提供一个同源修复的模板DNA，则可对靶基因区域进行定向改造，其原理如图1所示。

CRISPR/Cas9系统具有具有操作简单、价格低廉、效率高等优点，但也会存在一定的脱靶现象。CRISPR的脱靶现象会增加疾病治疗的风险，阻碍临床的进一步应用，所以提高CRISPR/Cas9精确性和解决CRISPR/Cas脱靶问题是基因编辑领域的重中之重。目前主要是通过寻找新的CRISPR/Cas系统和进化改造现有的Cas蛋白。但是如何使用简单高效的方法高通量检测CRISPR系统基因编辑器的编辑效率、编辑图谱和脱靶效应，无疑是现在亟待解决的一个问题。

CRISPR/Cas系统只需要一个靶向目标序列的gRNA就能引导Cas相关核酸酶结合相应的基因序列，并指导切割该位点。为了提高Cas9的特异性，科学家除了寻找Cas9同系物外，还通过Cas9改造来提高CRISPR/Cas9系统的特异性，该策略主要是通过基因工程手段使Cas9的双链切割突变为单链切割。这样只有2条sgRNA同时发生错配时才会发生脱靶，这就会极大降低脱靶效应。Cas9蛋白都需要gRNA引导才能切割DNA，因此通过调整gRNA来提升特异性就适用更多情况，有研究表明截短的gRNA(小于20bp)和发卡结构的gRNA能使编辑效率提高且大幅度降低脱靶率。但是如何高通量检测这些方法的编辑效率和脱靶效应是一个非常重要的问题。

现有检测基因编辑效率和脱靶效应的技术主要包括以下几种：细胞外检测方法，例如Digenome-seq，CIRCLE-seq，SITE-seq等，这些技术都是在体外用CRISPR/Cas9切割基因组DNA，然后高通量测序分析基因编辑效率和脱靶情况，显然这种脱离细胞本身的检测方法难以预测真实细胞内发生的编辑现象。细胞内检测方法，例如GUIDE-seq，DISCOVER-seq，GOTI等，与细胞外检测技术相比，这些方法能很好地模拟细胞内的脱靶现象。GUIDE-seq技术需要一种短双链寡核苷酸来标记CRISPR-Cas诱导的脱靶断裂，然后高通量检测标签所在的基因组区域预测脱靶位置，但该方法不能检测基因脱靶的详细情况，也不能用来检测基因编辑图谱。DISCOVER-seq技术是一种利用DNA修复因子同时结合染色质免疫共沉淀和高通量测序的方法。GOTI技术利用双细胞胚胎注射gRNA和核酸酶来评估核酸酶的脱靶效应。这两种方法虽然提高了检测的准确性，但操作相当复杂，限制了其在基础研究的应用。

总而言之，现有检测基因编辑效率和脱靶效应的技术的缺陷包括：(1)测序成本相对较高，需要全基因组测序，浪费测序资源；(2)通量不足，无法同时检测上千条gRNA的编辑效率和编辑图谱，无法同时检测成百上千条gRNA的脱靶效率；(3)部分检测技术需要较复杂精细的操作过程，如DISCOVER-seq需要免疫共沉淀；GOTI需要胚胎受精卵注射及全基因组测序等。