[发明专利]一种基于低温等离子体肿瘤细胞疫苗的制备方法

说明书

本发明公开了一种基于低温等离子体肿瘤细胞疫苗的制备方法，涉及生物医药领域。本发明发现低温等离子体可显著的杀伤肿瘤细胞，如黑色素瘤细胞等；注射低温等离子体灭活的肿瘤细胞可以有效抑制体内肿瘤生长，或利用低温等离子体直接辐照原位肿瘤可以有效抑制转移瘤的发生和发展，为后续低温等离子体在癌症治疗领域的应用开辟新思路。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于低温等离子体肿瘤细胞疫苗的制备方法。

背景技术

恶性肿瘤即癌症，是全球面临的重大疾病之一，现有的癌症治疗手段，如放疗、手术、靶向治疗等，具有一定的疗效，但也存在较大的局限性。肿瘤疫苗作为近年来肿瘤治疗研究热点之一，通过将肿瘤疫苗导入患者体内，进而增强免疫原性，激活免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而控制肿瘤生长转移或清除肿瘤。肿瘤疫苗主要包括四种类型：细胞疫苗，多肽疫苗、基因工程疫苗、抗体肿瘤疫苗。目前，肿瘤细胞疫苗的获取手段主要是通过物理、化学或生物方法(紫外线照射、加热等)处理自体或同种异体来源的肿瘤细胞，进而获取保留了免疫原性，无致瘤性的细胞疫苗。

低温等离子体(Non-thermal Plasma，NTP)，作为物质的第四态，主要包含电子、离子和中性粒子等多种自由基，被广泛的应用于生物医学领域，如灭菌、美白、促进伤口愈合等。近年来，研究证明，在体外细胞模型中，低温等离子体可以显著的杀死多种癌细胞。同时，在荷瘤小鼠模型中发现，低温等离子体能够抑制瘤体的生长速度。作为一种新型技术，低温等离子体具有较强的可操控性，精确的作用范围、接近人体的温度等优点，正在被开发成为一种新的癌症治疗手段。因此，基于低温等离子体技术制备肿瘤细胞疫苗及开发新型的低温等离子体癌症治疗手段具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于低温等离子体肿瘤细胞疫苗的制备方法。

发明人长期致力于低温等离子体杀伤肿瘤细胞等相关研究。研究发现，在体外细胞实验中，低温等离子体能够有效的杀死多种肿瘤细胞；在荷瘤小鼠模型中，低温等离子体可以抑制体内瘤体的生长。在前期基础上，本申请主要开发了相关的肿瘤细胞疫苗，通过注射低温等离子体灭活的肿瘤细胞，抑制瘤体的形成率和生长速度，开拓了低温等离子体在肿瘤免疫治疗中的应用范围。

第一方面，本发明提供低温等离子体肿瘤细胞疫苗的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)以肿瘤细胞为对象，进行培养并调整细胞状态至生长对数期；

2)收集步骤1)中处于对数生长期的肿瘤细胞并洗涤细胞，蛋白酶酶解细胞后离心收集，并调整细胞浓度至3*10⁵～5*10⁵细胞/毫升；

3)步骤2)处理后的肿瘤细胞低温等离子体直接或间接处理30秒～30分钟；

4)将步骤3)低温等离子处理获得的肿瘤细胞继续培养4～48小时，蛋白酶酶解后离心收集灭活细胞，即获得肿瘤细胞疫苗。

优选地，步骤1)中肿瘤细胞在37℃，5％CO₂条件下，于含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基中进行培养，待细胞融合度达到80％～90％时，进行传代培养。

优选地，步骤2)使用预热PBS洗涤细胞，蛋白酶优选胰蛋白酶，使用预热PBS或DMDM高糖培养基调整细胞浓度至3*10⁵～5*10⁵细胞/毫升。

优选地，步骤3)中低温等离子体可以选自选自射流低温等离子体、介质阻挡放电低温等离子体、空气多针低温等离子体中的一种或多种。

在一具体实施方式中，所述低温等离子体为介质阻挡放电低温等离子体。

优选地，步骤3)中低温等离子体的工作气体为空气和/或惰性气体。