[发明专利]强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用

权利要求书

1.强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用，所述的葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因为SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的异源蛋白为胰蛋白酶、纳豆激酶或碱性蛋白酶。

3.根据权利要求1所述的应用，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌WX-02。

4.根据权利要求1所述的应用，所述的强化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的地衣芽胞杆菌的构建方法，包括下述步骤：

（1）以地衣芽胞杆菌的基因组DNA为模板，PCR扩增出zwf基因，及用于整合表达zwf的上游同源臂A和用于整合表达zwf的下游同源臂B；

（2）通过重叠延伸PCR将用于整合表达Zwf的上游同源臂A、zwf基因和用于整合表达Zwf的下游同源臂B连接到一起，构成目的基因片段；

（3）采用XbaI和BamHI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

（4）准备质粒 T2(2)-ori，并采用XbaI和BamHI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

（5）将步骤（3）得到的酶切基因片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA 连接酶进行连接，得到基因整合表达质粒T2(2)-zwf；

（6）将基因整合表达质粒T2(2)-zwf转入地衣芽胞杆菌中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

（7）将阳性转化子转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到用于整合表达zwf的上游同源臂A或用于整合表达zwf的下游同源臂B与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（8）挑选用于整合表达zwf的上游同源臂A与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与用于整合表达zwf的下游同源臂B与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到Zwf强化表达的地衣芽胞杆菌；

以上所述的Zwf为葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因。

5.根据权利要求2所述的应用，当采用葡萄糖6-磷酸脱氢酶强化表达的地衣芽胞杆菌在胰蛋白酶、或纳豆激酶或碱性蛋白酶的异源蛋白生产时，所使用的发酵培养基的配方包括：10-20g/L葡萄糖、5-13g/L大豆蛋白胨、8-12g/L玉米浆，7-11g/L酵母粉，8-12g/L氯化钠，2-5g/L K₂HPO₄和4-8g/L(NH₄)₂SO₄；或5-10g/L骨蛋白胨、5-10g/L大豆蛋白胨、8-12g/L玉米浆、7-11g/L酵母粉、8-12g/L氯化钠、2-5g/L K₂HPO₄和4-8g/L(NH₄)₂SO₄。