[发明专利]一种蛋白动态表达调控系统及其在莽草酸生产中的应用

权利要求书

1.一种蛋白动态表达调控系统，其特征在于，在大肠杆菌中，该系统通过组合使用生长期关联启动子P_GPP和C末端降解标签SsrA作用于靶蛋白，实现对靶蛋白的动态表达，其中，所述靶蛋白受生长期关联启动子P_GPP控制，且含有C末端降解标签SsrA；所述生长期关联启动子P_GPP包括P_rpsL、P_rrnA、P_rpsT、P_rrnC或P_rpsA；所述C末端降解标签SsrA包括LAA、DAS、DAS+4、DAS+8或GSD；所述P_rpsL、P_rrnA、P_rpsT、P_rrnC或P_rpsA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.5所示；所述LAA、DAS、DAS+4、DAS+8或GSD的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.10所示。

2.如权利要求1所述的调控系统，其特征在于，所述靶蛋白为莽草酸激酶I或绿色荧光蛋白GFP。

3.如权利要求2所述的调控系统，其特征在于，所述靶蛋白为莽草酸激酶I。

4.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主菌，引入权利要求1所述动态表达调控系统控制靶蛋白的表达。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌敲除了莽草酸激酶I基因aroK和莽草酸激酶II基因aroL，并将菌株的PTS系统替换为葡萄糖易化蛋白基因Zmglf。

6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为敲除了莽草酸激酶I基因aroK和莽草酸激酶II基因aroL并将PTS系统替换为来源于运动发酵单胞菌的葡萄糖易化蛋白基因Zmglf的E. coli MG1655。

7.一种构建如权利要求4-6任一项所述的基因工程菌的方法，其特征在于，具体步骤包括：（1）构建基因工程改造质粒，所述质粒为PJ01-GABE和p15A-P_GPP-aroK-SsrA；（2）将所述质粒转化至大肠杆菌；（3）混合培养得到接合转移的莽草酸生产菌，其中，

所述步骤（1）中质粒PJ01-GABE的构建方法为：以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别扩增获得含有B0034RBS的aroB^opt、aroE、aroG^fbr、tktA片段，将aroB^opt、aroE两个片段采用多片段一步同源重组的方式，插入至pJ01的表达框中，获得pJ01-BE质粒，将aroG^fbr、tktA两个片段采用多片段一步同源重组的方式，插入至质粒pJ01的表达框中，获得pJ01-GA质粒，使用BamHI和XbaI限制性内切酶切割pJ01-GA质粒，回收载体，使用BgIII和XbaI限制性内切酶切割pJ01-BE质粒，回收片段；采用同尾酶连接的方式分别组装pJ01-GA和pJ01-BE质粒，最终获得质粒PJ01-GABE；

所述步骤（1）中质粒p15A-P_GPP-aroK-SsrA的构建方法为：合成生长期启动子P_GPP序列，替换载体pTet-1中原有的P_tet启动子，获得的质粒命名为p15A-P_GPP，以大肠杆菌MG1655基因组为模板，扩增基因aroK，并在其3’端融合不同的降解标签SsrA,将融合有不同降解标签的aroK-SsrA插入至p15A-P_GPP中获得质粒p15A-P_GPP-aroK-SsrA。

8.一种生产莽草酸的方法，其特征在于，以权利要求4-6任一项所述的基因工程菌为发酵微生物，以葡萄糖为碳源进行发酵。