[发明专利]利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L-鸟氨酸的方法

说明书

本发明公开了利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L‑鸟氨酸的方法，属于属于生物化工领域。该方法包括以下步骤：（1）重组谷氨酸棒杆菌：在谷氨酸棒杆菌中敲除MtlR的编码基因，然后在谷氨酸棒杆菌中通过插入强启动子P_NCgl0824的策略过表达甘露醇脱氢酶的编码基因mtlD，获得重组谷氨酸棒杆菌；（2）好氧发酵合成L‑鸟氨酸：将步骤（1）获得的重组谷氨酸棒杆菌接种于含有甘露醇、玉米浆等成分的发酵培养基中进行好氧发酵生产L‑鸟氨酸。本发明所提供的方法采用了谷氨酸棒杆菌为生产菌株，以海藻水解液的主要成分甘露醇为底物合成L‑鸟氨酸，有潜力代替葡萄糖成为发酵L‑鸟氨酸的主要碳源，缓解L‑鸟氨酸工业规模化生产与人类竞争粮食的问题。

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L-鸟氨酸的方法。

背景技术

L-鸟氨酸是尿素循环的中间代谢产物，对体内氨的排泄具有重要的作用。L-鸟氨酸虽然不编码蛋白质，但存在于短杆菌酪肽、短杆菌肽S等抗菌肽中，具有保护肝脏、增强免疫力等功能。

L-鸟氨酸还被广泛应用于食品、医疗、化工等领域：食品方面，L-鸟氨酸是食品添加剂的主要成分之一，可用于制备乳制食品、肉制食品、烘焙食品、面制食品等；医疗方面，L-鸟氨酸可用于制备保肝护肝药物门冬氨酸鸟氨酸、天冬氨酸鸟氨酸等；化工方面，L-鸟氨酸可代替甘油用于烟丝的加香、防冻保湿剂，用作洗面奶、洗发水、美容霜等的添加剂；饲料方面，L-鸟氨酸可用于制备宠物罐头、动物饲料、水产饲料、兽药产品等。

目前国际市场对L-鸟氨酸总需求量超过5000吨，而主要生产厂家有味之素、田道制药和协和发酵三家企业，产量供不应求。市场上，医药级L-鸟氨酸的单价为35-40万元/吨，价格昂贵。

工业上生产L-鸟氨酸主要有化学法、酶法及工业发酵法，其中，化学法合成L-鸟氨酸存在操作工艺复杂、反应条件要求苛刻及破坏环境等缺点，酶法需要以价格昂贵的精氨酸和精氨酸酶为原料，生产成本受制于精氨酸的价格。而发酵法则是以葡萄糖为底物，通过工程菌种自身体内的生物代谢途径将葡萄糖转化为L-鸟氨酸。与化学法、酶法相比，利用微生物发酵法合成L-鸟氨酸因具备生产成本低、环境污染小等优势而日益成为研究者们关注的焦点。

虽然利用微生物发酵法合成L-鸟氨酸具有广阔的应用前景，但是这种方法需要消耗大量的底物葡萄糖，而工业用葡萄糖主要的来源是淀粉的水解。在地球耕地面积不断减少，人口数量又不断增加的大环境下，以葡萄糖为原料合成L-鸟氨酸显然面临着与人类竞争粮食的问题，并且这个问题所带来的负面影响将与日俱增。

因此有必要提供一种新的L-鸟氨酸发酵生产方法，利用其他碳源替代葡萄糖进行发酵合成L-鸟氨酸，缓解L-鸟氨酸规模化生产与人类竞争粮食的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种新的利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L-鸟氨酸的方法。

为达到以上目的，本发明采用以下技术方案：

利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L-鸟氨酸的方法，包括以下步骤：

（1）重组谷氨酸棒杆菌：构建含有敲除负调控蛋白MtlR同源上下臂的重组质粒，导入谷氨酸棒杆菌，敲除负调控蛋白MtlR的编码基因mtlR；然后将强启动子为P_NCgl0824启动子插入在mtlD基因上游非编码区，强化表达甘露醇脱氢酶的编码基因mtlD，获得重组谷氨酸棒杆菌；