[发明专利]一种β-半乳糖苷酶、基因、工程菌及其应用

权利要求书

1.一种来源于产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)ZJUH1705的β-半乳糖苷酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。

2.一种权利要求1所述β-半乳糖苷酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

3.一种权利要求1所述β-半乳糖苷酶在催化乳糖制备低聚半乳糖中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含β-半乳糖苷酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞再经超声破碎、分离纯化后获得的酶液作为酶源，加入pH值为6.0～9.0的缓冲溶液和乳糖构成转化体系，在20～40℃、100～300rpm条件下振荡反应30～60h，反应结束后，即得低聚半乳糖粗品。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述酶源的用量以底物质量计为1～4U/g，所述缓冲液体积加入量以乳糖重量计为1-10mL/g。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于反应条件为40℃、200rpm反应48h。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH 7.0、0.05M磷酸缓冲液。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备：(1)湿菌体的制备：将含β-半乳糖苷酶基因的重组工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，20～37℃、100～200rpm振荡培养6～12h，将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至培养液的OD₆₀₀达到0.6～0.9时，向培养液中加入终浓度为0.1～1mM的IPTG，20～37℃、200rpm继续诱导培养6～12h，将所得培养液离心，收集湿菌体；(2)酶液的制备：将步骤(1)湿菌体加50mM、pH 7.5的磷酸缓冲液中进行超声波破碎，超声处理条件为：超声功率200W、超声处理1s后，间歇2s，反复处理共30min，破碎后样品经10000rpm、4℃离心10min，所得上清液即为粗酶液；将粗酶液上样于用结合缓冲液平衡好的Ni柱，再次平衡后以洗脱缓冲液洗脱，收集含有酶活的洗脱液，所得洗脱液经透析袋透析后即为所述酶源；所述结合缓冲液组成为：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，20-40mM咪唑，溶剂为水；所述洗脱缓冲液组成为：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，300-500mM咪唑，溶剂为水。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述结合缓冲液组成：20mM磷酸钠，0.5MNaCl，40mM咪唑，溶剂为水；所述洗脱缓冲液组成20mM磷酸钠，0.5M NaCl，0.5M咪唑，溶剂为水。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述上样和洗脱流速均为1mL/min。