[发明专利]一种建立DSE和AMF与植物共生体系的方法及其应用

权利要求书

1.一种建立 DSE和 AMF与植物共生体系的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1，DSE 和AMF 的活化和培养

S101， DSE 的活化、扩繁培养

将低温保存的DSE 菌株活化后，无菌条件下，接种到盛有马铃薯蔗糖琼脂培养基的培养皿中，于 28℃恒温黑暗培养 45d；

S102， AMF 扩繁

将含有AMF 纯菌种的沙土菌剂与灭菌沙土按质量百分比 3:1 混合后放置于灭菌花盆中，再将无菌植物苗移栽至花盆中，按时浇洒无菌水以保证植物根系正常生长的水分需求，培养 90d；

将花盆置于日光下暴晒 3d 使沙土培养基处于干燥状态，除去植株地上部分，随机选取少量须根用于侵染状况检测,剩余根系烘干粉碎放入沙土培养基中混合后，装入塑封袋进行低温保存；

S2，植物无菌苗的培养

用 75%乙醇和 10%次氯酸钠对植物种子进行表面消毒，先将植物种子置于 75%乙醇浸泡 30-60 秒，再将种子置于 10%次氯酸钠溶液中消毒 10min，最后用无菌水冲洗种子 4-5次后，再将种子置于无菌水中浸泡 20min 使种子充分吸水饱胀；

充分吸水饱胀的植物种子接种到垫有无菌水浸湿已灭菌培养皿中，加入少量无菌水，于 28℃光照培养箱中暗处理 3d，待种子萌发露白 1cm，挑选无污染且生长一致的幼苗备用；

S3， DSE 和植物共生体系的建立

S301，共生培养基的制备

选取圆柱形玻璃容器，定量加入珍珠岩和霍格兰溶液，用无菌透气封口 膜封口，于高压蒸汽灭菌锅 121℃灭菌 1h，取出置于无菌操作台中冷却备用；

另取一份河沙灭菌备用；

S302， DSE 与无菌植物幼苗的接种

无菌条件下，将培养于马铃薯蔗糖琼脂培养基中的DSE 菌株切成 2-3cm

的正方形菌块置于圆柱形共生培养基质内，混匀；

在每个共生培养基质中接入 2 棵无菌幼苗，用培养基将幼苗根部埋好， 上部覆一层1cm 的灭菌沙盖住幼苗，用无菌透气封口膜封住共生培养基质容器口；

S4， DSE-植物共生体系的培养

无菌幼苗和DSE 接种到共生培养基后，于温度 20-26℃，光照 10 h， 光照强度 1000-8000 Lux 的条件下连续培养 15 d；

S5， DSE-植物共生培养体系的检测

共生培养 15d，将植物从共生培养基中分离，用蒸馏水冲洗根系 3-5 次， 随机挑选部分根段放入装有 10ml10% 氢氧化钾溶液的试管中，于 90℃恒温水浴锅中解离 2 h，取出根段，冷却并置于培养皿中用蒸馏水冲洗 3-5 次，滴加乳酸中和残留氢氧化钾；

根段采用蓝墨水和乳酸甘油混合染色剂进行染色，乳酸甘油脱色后，将根样剪切成 4-5cm，制片并于显微镜下镜检观察DSE 定殖情况；

当部分根段在镜检下观察到DSE 的典型有隔内生菌丝时，则表明DSE-

植物共生体系成功建立；

S6， AMF 和DSE-植物共生体系的建立

在灭菌花盆中装入定量的灭菌土壤，在灭菌土壤三分之一厚度处均匀撒上定量的AMF菌剂，再覆盖灭菌土壤，将DSE-植物共生体移栽至花盆；定时定量浇洒蒸馏水和霍格兰营养液；培养周期视具体植物而定；

S7， AMF-DSE-植物共生培养体系的检测

将植物从花盆中取出，用蒸馏水洗净根系，放入试管，添加 10%氢氧化钾 10ml，于 90℃水浴锅解离 2 h，经蓝墨水和乳酸甘油混合染色剂染色、脱色以及制片过程后，于显微镜下进行镜检观察AMF、DSE 定殖情况，当部分根段分别有泡囊、丛枝AMF 典型结构以及侵入点，深色有隔菌丝、微菌核DSE 典型结构时，则表明AMF-DSE-植物共生体系成功建立。

2.根据权利要求 1所述的一种建立DSE和AMF与植物共生体系方法的应用，其特征在于，该方法作为DSE和AMF与植物的相互关系研究、DSE和AMF形态学方面的研究，疑似DSE和AMF 菌株初步检测以及DSE和AMF 接种的应用。