[发明专利]一种植物抗虫基因mCry2Ab及其载体和应用

说明书

本申请公开了一种人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mCry2Ab以及用于植物抗虫的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO 3。本申请还公开了相应的载体，以及蛋白质、基因在抗虫害中的应用。本申请改造后的mCry2Ab基因转入植物后，所获得的高表达mCry2Ab蛋白的转基因植物具有甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗性，较Cry2Ab和经过核苷酸修饰的yCry2Ab抗性更好。

技术领域

本申请涉及基因工程生物防治技术领域，具体而言涉及人工改造的抗虫基因mCry2Ab及其表达载体及应用。

背景技术

Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(BacillusthuringHansis)。在其芽孢形成过程中会产生δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白，这些蛋白具有很高的杀虫活性。其作用原理为这种抗虫蛋白能被碱性肠液溶解，水解为更小的活性毒素片段-核心片段(Hofte和Whiteley，1989)。该活性片段能抗蛋白酶的进一步水解，被激活的蛋白质结合在昆虫肠道上的刷状小泡上，引起穿孔从而影响渗透平衡，细胞膨胀并溶解，靶标生物停止取食并最后死亡。研究表明许多靶标害虫的肠道上皮细胞都具有Bt蛋白高亲和性的结合位点(Hofte和Whiteley，1989)。在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种它们编码的杀虫晶体蛋白。

生物防治是利用某些有益生物或生物代谢产物来控制害虫种群数量，以达到降低或消灭害虫的目的，如用赤眼蜂或白僵菌防治草地螟。其特点是对人、畜安全，对环境污染少，对某些害虫可达到长期控制的目的；但是效果常不稳定，并且不论草地螟发生轻重均需同样投资进行。

为了解决农业防治、化学防治、物理防治和生物防治在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。

Cry2Ab杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，1981年Schenpf和Whiteley从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆了第一个编码δ-内毒素的cry基因Cry1Aa1。1989年Widner W.R和Whiteley H.R从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆了Cry2Ab基因。Cry2Ab蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性pH环境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病征，破坏细胞膜内外的渗透压变化及pH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。

孟山都在公开号为CN1332800A的中国专利申请中对Cry2Ab特定的核苷酸和氨基酸序列进行了保护，同时对该蛋白的细胞器定位和使用的信号肽进行保护。在申请日为2014-09-19公开号为CN104313036A的中国专利申请中中国农大赖锦盛教授对Cry2Ab核苷酸序列进行了修饰和调整，提高了其对东方黏虫的抗性。在申请日为2013-12-12公开号为CN103688974A的中国专利申请中，北京大北农生物技术有限公司针对原核苷酸序列和氨基酸序列开发了应用于国内一些新虫子的抗性的新用途，Cry2Ab基因和yCry2Ab基因在部分夜蛾科害虫的抗性上存在抗性不足的问题，例如对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾抗性存在不足，针对该基因的上述技术问题本发明对该基因的核苷酸序列进行了调整，该调整造成了两个氨基酸序列的改变，本发明以孟山都公司Cry2Ab基因原序列和中国农大赖锦盛教授修饰了核苷酸序列的yCry2Ab基因为对照，构建了载体，进行了甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗性测定，本发明经过氨基酸调整的mCry2Ab基因能够有效的提高甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗性。

发明内容

针对上述技术问题，本申请的目的在于提供一种的mCry2Ab基因，改造后的mCry2Ab基因转入植物后，所获得的高表达mCry2Ab蛋白的转基因植物具有甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗性，较原始Cry2Ab和仅对核苷酸修饰后的yCry2Ab抗性更好。