[发明专利]一种谷氨酸脱氢酶突变体、编码基因及制备L-草铵膦的方法

说明书

本发明公开了一种谷氨酸脱氢酶突变体、编码基因及制备L‑草铵膦的方法。本发明通过定向进化与半理性设计相结合的分子改造方法，显著提高了源于Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶对PPO的催化活力；解决了还原胺化法制备L‑草铵膦工艺中NADH特异性谷氨酸脱氢酶酶活几乎没有酶活的问题；本发明谷氨酸脱氢酶突变体对PPO的催化活力显著提高，LB培养基摇瓶发酵的酶活最高达16.14U/mL；本发明谷氨酸脱氢酶突变体在L‑草铵膦的制备中，表现出良好的催化效率，底物转化率99％，L‑草铵膦浓度最高达83.6g/L，ee值99％，具有非常大的工业应用前景；本发明成功的解决了氨化还原反应制备L‑草铵膦过程中的生物催化剂活力低和辅酶稳定性的关键问题，为实现该工艺的工业化应用奠定了基础。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种谷氨酸脱氢酶突变体、编码基因及制备L- 草铵膦的方法。

背景技术

草铵膦(Phosphinothricin，又名Glufosinate)是一种含磷氨基酸类灭生性除草剂，化学名称为2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，是全球第三大灭生性除草剂及第二大转基因作物除草剂，具有杀草谱广、低毒、活性高以及环境相容性好等优点。草铵膦有两种光学异构体，其中只有L-草铵膦具有除草活性。但目前，市场销售的草铵膦都是外消旋体混合物(D,L-草铵膦)，若能够以L-构形的纯光学异构体形式使用，草铵膦施用量将降低50％，可显著提高经济性、减轻环境压力。因此，光学纯L-草铵膦制备工艺的开发具有非常重要的意义。

谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,EC 1.4.1.2～1.4.1.4)来源丰富且性质多样，在手性L-氨基酸合成领域具有非常大的应用潜力。利用谷氨酸脱氢酶催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)不对称还原胺化制备L-草铵膦，具有立体选择性严格、理论产率能够达到100％、产物易于分离提纯等显著优势。

专利CN106978453A通过筛选得到了酶活较高的谷氨酸脱氢酶，酶活最高达到35.54U/L (0.03554U/mL)，并在额外的辅酶再生体系配合反应下，制备了L-草铵膦，原料PPO转化率高达100％。

专利CN110184246A通过基因工程改造、获得了一种酶活更高的谷氨酸脱氢酶突变体，酶活最高达到11.21U/mL，在葡萄糖脱氢酶的配合下制备L-草铵膦，原料PPO转化率99％，产品ee值99％。但目前对PPO具有催化活力的谷氨酸脱氢酶都是NADP⁺/NADPH辅酶依赖型，辅酶NADP⁺/NADPH的价格是辅酶NAD⁺/NADH的2～3倍，导致L-草铵膦生产成本中辅酶的成本占比过高。

来源于Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶(CdGluDH，NCBI登录号：YP_001086649.1) 是NADH特异性谷氨酸脱氢酶，相较于NADPH特异性的酶来说辅酶成本更低，稳定性更好，但原始CdGluDH不能够还原胺化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸生成L-草铵膦。

发明内容

本发明针对来源于Clostridium difficile的原始谷氨酸脱氢酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示)对非天然底物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸没有酶活的问题，提供了多个酶活显著提高的谷氨酸脱氢酶突变体，这些突变体可以用于制备L-草铵膦。

一种谷氨酸脱氢酶突变体，为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的野生型谷氨酸脱氢酶突变所得，突变方式为以下一种：

(1)A145G、I174S、V352A或I408F；