[发明专利]一种醇脱氢酶突变体及应用

说明书

本发明公开了一种醇脱氢酶突变体及应用。所述醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述醇脱氢酶突变体由野生型酶经22个位点的点突变获得，显著提高了在大肠杆菌中活性表达能力。以异丙醇为底物，本发明的醇脱氢酶突变体的催化活力和热稳定性显著提高。通过强化大肠杆菌中分子伴侣GroES‑EL蛋白的表达，构建了一种全新的大肠杆菌基因工程菌，用于表达所述醇脱氢酶突变体，基本解决了包涵体的问题，发酵酶活进一步提高至38.20U/mL。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种醇脱氢酶突变体及应用。

背景技术

醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)是广泛存在于细菌和真核生物中的一种酶。醇脱氢酶在一定条件下，可以催化醇的氧化脱氢，生成相应的酮，与此同时将氧化型辅酶NAD(P)⁺转化为还原型辅酶NAD(P)H；也可以在消耗等量的还原型辅酶NAD(P)H的同时、将酮还原为相应的醇。因此，醇脱氢酶在辅酶的循环再生、手性醇的不对称合成等领域中有广泛的应用。来自拜氏梭菌Clostridium beijerinckii的醇脱氢酶(下称CbADH)是一种NADPH依赖型醇脱氢酶，以异丙醇为底物再生NADPH时、其单位蛋白的活力是目前文献报道的较高水平。

Edi Goihberg等人(A Single Proline Substitution is Critical for theThermostabilization of Clostridium beijerinckii AlcoholDehydrogenase.PROTEINS:Structure,Function,and Bioinformatics 66:196–204(2007))比较了多种NADPH依赖型醇脱氢酶、如来源于布罗基热厌氧菌Thermoanaerobacterbrockii的TbADH，来源于痢疾变形虫Entamoeba histolytica的EhADH1，以及来源于拜氏梭菌Clostridium beijerinckii的CbADH的催化活力，其中，CbADH的K_cat值为9714min^-1，远高于TbADH(1724min^-1)和EhADH1(3025min^-1)，这说明CbADH比活力最高。

由于野生菌Clostridium beijerinckii表达CbADH的总量较低，而且培养过程复杂、产量低，因此，需要对CbADH进行异源重组表达。大肠杆菌基因工程菌是一个重组蛋白生产的首选菌株：它在廉价的培养基质中可以达到较高的细胞生长密度，而且，其遗传学研究有较为透彻，并有大量的改造过的克隆载体来实现包括酶在内的各种蛋白质的生物合成。使用常规的大肠杆菌基因工程菌重组表达CbADH，提高了其总体表达量。但在大肠杆菌基因工程菌中表达CbADH时，重组基因产物的高水平表达导致了酶蛋白的错误折叠，形成了大量的不具有生物活性的聚集体、即包涵体，限制了CbADH的工业化应用。例如，Moshe Peretz等人(Molecular Cloning,Nucleotide Sequencing,and Expression of Genes EncodingAlcohol Dehydrogenases From the Thermophile Thermoanaerobacter brockii andthe Mesophile Clostridium beijerinckii.Anaerobe(1997)3,259–270)在大肠杆菌Escherichia coli strain TG1中异源表达了CbADH，酶活只有3.38U/mL发酵液(底物为异丙醇，测活温度为40℃)。

发明内容