[发明专利]一种橘色双冠丽鱼黑色素细胞分离和培养方法

权利要求书

1.一种橘色双冠丽鱼黑色素细胞的构建方法，其特征在于，该方法为：将双冠丽鱼鱼尾鳍、皮肤、鳞片放入胰蛋白酶中进行消化，收集细胞，再放入胶原酶溶液中进行消化，然后依次加入不同浓度percoll试剂，收集细胞进行原代培养和传代培养即可获得橘色双冠丽鱼黑色素细胞；

包括以下步骤：

1）组织消化：将双冠丽鱼鱼尾鳍、皮肤、鳞片放入胰蛋白酶消化，收集细胞，再加入胶原酶溶液中消化，收集消化后的细胞；再依次加入55%percoll试剂、45% percoll试剂、35%percoll试剂，离心收集45%-35%percoll两层之间细胞；

2）原代培养：将上步收集的细胞加入KC1细胞培养基制成细胞悬液，进行原代培养；

3）传代培养：当原代培养细胞铺满培养瓶底80～90%时，去培养液，胰蛋白酶消化，消化后去酶液，加入KC培养基纯化细胞，当细胞铺满培养瓶底80～90%时，加入MC2培养基将细胞重悬进行传代培养；

步骤1）所述胶原酶溶液含有牛血蛋白、胶原酶I、DNase I、以及大豆胰蛋白酶抑制剂；

步骤2）所述KC1细胞培养基含有K-SFM 培养基，10～11%胎牛血清，10～12 ng/mL TPA，20～22ng/mL bFGF，1～2%双抗；

步骤3）所述KC培养基含有K-SFM 培养基，5～8%胎牛血清，10～12 ng/mL TPA；所述MC2培养基含有DMEM培养基，20～25%胎牛血清，1～2ng/mL TPA，20～22ng/mL bFGF，1～2%双抗。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述双冠丽鱼鱼尾鳍、皮肤、鳞片为剪碎的鱼尾鳍、皮肤、鳞片。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1）所述胰蛋白酶消化温度为25℃～28℃，消化时间为6～8h。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1）所述胶原酶溶液消化温度为25℃～28℃，消化时间为12～15h。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1）依次加入的55%percoll试剂、45% percoll试剂、35% percoll试剂的体积为2～3mL。

6.橘色双冠丽鱼黑色素细胞系在培养鱼类色素细胞中的应用，其特征在于，所述橘色双冠丽鱼黑色素细胞系的构建方法为权利要求1～5任一所述的方法；所述鱼类为橘色双冠丽鱼。