[发明专利]一种评价RNAi转基因产品对意大利蜜蜂影响的方法

说明书

本发明公开了一种评价RNAi转基因产品对意大利蜜蜂影响的方法，首先进行dsRNA的合成，包括以下步骤：步骤1：引物设计：以转SMV‑P3‑RNAi基因抗病大豆B5B9013为试验材料，根据B5B9013大豆中的SMV‑P3基因正向干扰片段序列和GFP基因序列，设计引物，扩增获得用于dsRNA合成的DNA模版；步骤2：dsRNA反转录：采用MEGAscript转录试剂盒进行dsRNA的合成。本发明以转SMV‑P3‑RNAi基因抗病大豆B5B9013为试验材料，根据B5B9013大豆中的SMV‑P3基因正向干扰片段序列和GFP基因序列，设计引物，扩增获得用于dsRNA合成的DNA模版，采用MEGAscript转录试剂盒进行dsRNA的合成，并进行dsRNA对蜜蜂的影响试验，试验结果表明，在进行RNAi转基因作物安全评价时，其表达的dsRNA能够提高经济昆虫家蚕的存活率。

技术领域

本发明涉及转基因植物技术领域，特别涉及一种评价RNAi转基因产品对意大利蜜蜂影响的方法。

背景技术

RNAi干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double strand RNA,dsRNA)触发的、经一系列内源固有基因表达调控机制，以小分子RNA为媒介特异性的抑制同源基因表达的一种真核调控系统(Hommon,2002)。RNAi干扰普遍存在于动植物、真菌和昆虫中，具有高效性、特异性、系统性和可遗传性等特点，目前已被广泛应用于基因功能分析、农作物转基因技术、疾病和肿瘤的分子治疗等研究领域。在农作物转基因研究领域中，研究者利用RNAi干扰的高特异性敲除或关闭指定基因，精确的改变转化株的某些性状，可实现提高产量、增强抗性或增加营养价值等改良目的。

RNAi技术自20世纪90年代被发现以来，已作为一种高效的基因抑制(geneknockdown)技术被广泛应用于作物生物技术育种领域，在抗病虫、耐非生物胁迫、品质改良等育种方面已取得显著的进展，RNAi干扰玉米、马铃薯等产品已进入商业化应用阶段(伍国强，2018)。Baum等根据美国西部玉米根虫(WCR)的V-ATPase A基因设计靶标dsRNA，通过dsRNA直接饲喂WCR、转基因玉米田间接虫、转基因玉米根系饲喂WCR等多种方式，证实靶标dsRNA可通过RNA干涉途径杀死WCR(Baum，2007)。杨向东等将大豆花叶病毒SC-3株系的P3基因RNAi片段导入栽培大豆品种，发现转基因大豆植株在田间条件下对SC-3、SC7、SC15、SC18、SMV-R等多个大豆花叶病毒株系及西瓜花叶病毒具有良好抗性，且抗性性状能稳定遗传(Yang，2018)。

尽管RNAi技术早在上世纪90年代就开始发现并应用，但是由于对RNAi干扰转基因作物的作用机制、外源RNA在哺乳动物体内的代谢和发挥干扰作用的情况了解不够透彻，科学界对于RNAi干扰转基因作物的安全性一直存在较大的争议。如基因水平转移、对非靶标生物和生物多样性影响等。

RNAi作物因靶外结合，对直接或间接接触dsRNA或siRNA的非靶标生物存在潜在风险。RNAi作物对非靶标生物产生实质影响一般需满足以下条件：转基因作物表达dsRNA；非靶标生物直接或间接取食dsRNA；dsRNA在非靶标生物体内不被降解；暴露量足以激发内源RNAi机制；导致非靶标生物体内特定mRNA降解或表达受抑制；该mRNA影响非靶标生物存活，进而导致种群数量发生显著变化(Roberts，2015)。由此可见，靶外结合并非一定会显著降低非靶基因表达，而基因表达受抑制也不一定会导致显著的负面影响。

家蚕(Bombyx mori)是我国重要的经济昆虫，丝绸产业在我国具有十分重要的经济、社会地位，西南、华北、华南三大区域成为我国的家蚕的主要产区(李建琴等，2018)，由于玉米、大豆等农作物的广泛种植，在很多地方存在种桑养蚕与农作物生产同步的现象。因此，家蚕饲养过程中有可能会直接接触外源dsRNA表达量较高的农作物花粉，在进行RNAi转基因作物安全评价时，有必要评价其表达的dsRNA对经济昆虫家蚕的影响。

发明内容