[发明专利]人类肠道病原菌感染诊断用鼠伤寒沙门菌特异性基因探针

说明书

本发明公开了一种类肠道病原菌感染诊断用基因芯片鼠伤寒沙门菌特异性基因探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过确定候选序列后，设计特异性引物，选用标准和临床分离的野生菌株进行PCR调查和相应的序列分析验证。根据验证的病原菌特异性探针序列，设计合成引物并经PCR扩增相应的特异性核苷酸片段，每个长约200核苷酸，再通过重叠延伸PCR将某种病原菌的3至5个特异性片段扩增链接，以此作为各种病原菌特异性的探针。本发明将多个基因的高度特异区域串联制成的探针，不但有较高的特异性，而且由于可同时与多个特异片段杂交使检测的灵敏度大为提高。

技术领域

本发明涉及基因技术领域，具体为一种人类肠道病原菌感染诊断用鼠伤寒沙门菌特异性基因探针。

背景技术

肠道致病菌的传统检测方法是在细菌培养的基础上，根据致病菌的生化反应及血清学试验进行鉴定，目前还存在许多不足之处：(1)受条件限制，许多细菌如厌氧菌的培养只有极少数的实验室能进行，大多数临床检验实验室存在漏检的问题；(2)检测周期长，尤其当遇到急性重症病人，因不能及时获得确切致病菌的诊断结果，往往对临床用药指导不力；(3)工作量大且效率低，我国微生物实验室检验粪便最常用的培养基是Mac琼脂和SS琼脂，碱性蛋白胨水， 4号琼脂等，主要针对沙门菌属、志贺菌属，弧菌属的检出，而对其他细菌的检验则需在上述选择性培养阴性基础上，再根据临床医生提供的临床症状有针对性地选用其他特殊培养基进行检验；(4)漏检真菌。因此，目前临床微生物实验室对腹泻粪便中病原菌培养的阳性率较低。此外，目前三级医院大都购置了进口的微生物鉴定系统，也是基于细菌培养和生化反应进行鉴定，它必须在适当的培养基上生长出致病菌，然后选择适当的鉴定卡，孵育一段时间后，通过自动判读致病菌的生化反应对细菌进行鉴定，同样对有些细菌只能鉴定到属，还需结合相应的血清学试验才能鉴定到种。所以，用微生物鉴定系统检测肠道致病菌省工不省时，也不能提高检测的阳性率。在得不到确切的病原菌检验结果情况下，临床医师也只能据一般病症采用抗菌药的联用，以期获得良好的治疗效果，此举也是加剧肠道致病菌耐药问题的主要原因。因此，迫切需要开展新技术的研究与应用，以提高肠道致病菌的检测率，降低肠道病原菌感染对人类健康的威胁。

近年来随着细胞和分子生物学的发展，许多常用的分子生物学技术，如PCR、多重PCR、荧光定量PCR等技术被临床实验室用于有关致病菌的检测。运用PCR 检测肠道感染的致病细菌时，虽有快速灵敏等优点，但也有易交叉污染，不能定量，一次只能检测一个基因等缺点；荧光定量PCR虽然能快速定量，但一次仍然只能检测一个基因(细菌)；多重PCR技术一次可检测多个基因(细菌)，但由于是根据PCR产物分子大小来区分，所以一次检测一般不超过6个基因(细菌)，即使是多重荧光定量PCR，其一次检测的目的基因(细菌)数量仍受限制，一般不超过10个。

基因芯片分析技术在细菌分子流行病学调查、细菌基因鉴定、基因突变及多态性分析、基因表达谱分析等方面已有许多研究报道，在病原微生物检测方面也有尝试。以往研究发现，运用基因芯片直接检测细菌时灵敏度较低，一次往往需要10^5～6菌量，为了提高灵敏度，多采用与PCR结合应用，如设计通用引物扩增各种细菌的保守基因，如16SRNA或23SrRNA基因，扩增产物经荧光标记后，再与芯片上固定的各种据保守基因的局部可变区设计的特异性探针进行杂交。利用此法虽可显著提高检测的灵敏度，但由于rRNA基因在同菌属内不同菌种之间的差异很小，对属内的种间区别很难。而且rRNA基因的二级结构和三级结构也常影响杂交效率，造成许多假阴性、假阳性结果。另外，也有基因芯片与多重PCR结合应用报道，据各种致病菌特异性标志基因，如毒性因子基因等制备芯片探针固定于芯片，利用特异引物对样品先进行多重PCR扩增，并同标记时荧光，然后与基因芯片进行杂交。此法虽兼顾了检测的特异性和灵敏度，但也有一定的局限性，主要是因为多重PCR扩增目的基因时，一次同时扩增的基因种类受限，因为引物对数量过多，引物间易形成二聚体影响扩增效率，因此在检测是往往需对一份样品进行数次多重PCR扩增，一定程度上削弱了基因芯片的高效性。因此，日前还没有非常成熟的基因芯片用于临床肠道致病菌的鉴别诊断。

发明内容