[发明专利]一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法

权利要求书

1.一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将田菁种子进行暗培养，需要照明时使用绿光灯，利用研磨缓冲液将定量田菁黄化苗破碎，先后通过纱布和尼龙网过滤获得组织匀浆液；

2)匀浆液通过差速离心去除组织碎片和细胞核，利用DNase I去除线粒体溶液中DNA，获得粗制线粒体；

3)粗制线粒体利用缓冲液重悬后，转移至由蔗糖铺成的不连续密度梯度液上，经过超高速离心，获得纯化的线粒体；

4)利用改良的SDS方法提取线粒体DNA，获得无蛋白和RNA污染的高纯度DNA；

5)对提取的田菁线粒体DNA进行浓度检测、电泳条带检测和纯度检测。

2.根据权利要求1所述的一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，其特征在于：步骤1)中，由于苗期生长速度的限制，采用培养2周的田菁作为线粒体提取材料，包括上下胚轴和叶片；在研磨缓冲液中加入半胱氨酸和β-巯基乙醇，降低线粒体的氧化损伤；匀浆液先用2层无菌的脱脂纱布过滤，再用2层100目的尼龙网过滤，在冰上收集滤液。

3.根据权利要求1所述的一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，其特征在于：步骤2)中，匀浆液在高速离心机中离心15min，转速2200g；将上清液再次高速离心15min，转速17000g；向沉淀中加入缓冲液和DNase I至其浓度为50μg/mL，冰浴1h加入EDTA终止反应；高速离心20min，转速18000g，获得粗制线粒体。

4.根据权利要求1所述的一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，其特征在于：步骤3)中，将线粒体沉淀重悬于缓冲液中，转移至由5mL 1.45M和5mL 1.2M蔗糖铺成的不连续密度梯度液上；超高速离心机离心90min，转速20600rpm；收集蔗糖梯度溶液之间的线粒体；高速离心机离心20min，转速20000g，沉淀即为纯化的线粒体。

5.根据权利要求1所述的一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，其特征在于：步骤4)中，向纯化的线粒体中加入裂解缓冲液，按照体系将蛋白酶K、SDS、RNase加入后37℃水浴3h，冷却至室温加入NH4AC溶液，之后按照常规提取DNA的方法将蛋白抽提干净，无菌水溶解保存获得高纯度线粒体DNA。

6.根据权利要求1所述的一种田菁线粒体及其DNA提取的有效方法，其特征在于：步骤5)中，利用酶标仪检测田菁线粒体DNA的浓度和纯度，琼脂糖(1％)凝胶电泳检测DNA的完整性，利用限制性内切酶EcoR I进行酶切，检测线粒体DNA的纯度。