[发明专利]一种检测过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种检测过氧亚硝酸根离子的荧光探针：。本发明所述的荧光探针具有高特异性，在进行相应过氧亚硝酸根离子的检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内过氧亚硝酸根离子的实时测定，具有广阔的应用前景。本发明所述的检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性，通过绘制标准曲线进行细胞内过氧亚硝酸根离子的测定，可以实现对细胞内过氧亚硝酸根离子的快速准确检测的目的。

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其应用。

背景技术

在生物体内一氧化氮除了能够发挥正常的生理功能外，还与一些细胞和组织损伤有关。现有证据表明，一氧化氮与超氧阴离子反应的产物为过氧亚硝酸根离子（ONOO-）。一方面过氧亚硝酸离子可以在机体的免疫系统中发挥辅助调节的作用。另一方面过氧亚硝酸根离子是一种强氧化性和强效细胞毒性物质，它是一氧化氮产生病理作用的原因，它能导致DNA损伤、酶抑制、细胞死亡和细菌中毒并能够引起一系列疾病。目前，已经发现在败血性休克、缺血-再灌注损伤、动脉粥样硬化、糖尿病、老年痴呆症等疾病中都有过氧亚硝酸根离子的存在。通过对自由基的检测研究，可以帮助我们更好的解释疾病产生的原因，可以采取有效的预防措施，减少其对机体的损伤程度，因此，开展对细胞内过氧亚硝酸根离子的检测是非常必要的。

生物体内过氧亚硝酸根离子的寿命非常短，导致通常情况下稳态浓度极低，而短寿命和低浓度意味着过氧亚硝酸根离子的测定非常困难。目前测定自由基的方法主要有电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法（HPLC）、化学发光法（CL）等，其中荧光探针分析法由于具有灵敏度高、简单易行、高选择性，并且小分子荧光探针还具有易合成、立体位阻小、结合位点多等优点。因此，在过氧亚硝酸根离子的检测中有着广阔的发展空间和应用前景。

发明内容

为了提供一种新的过氧亚硝酸根离子检测试剂，本发明提供一种检测过氧亚硝酸根离子的荧光探针，探针的响应速度快、抗干扰能力强。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞内过氧亚硝酸根离子的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测过氧亚硝酸根离子的荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）β-氨基丙酸和对甲苯磺酰氯在NaOH溶液中反应，反应结束后加入盐酸溶液，析出的沉淀纯化后获得化合物1：；

（2）4-二乙氨基酮酸与间羟基苯基哌嗪在CH₃COOF中回流反应，反应结束后分离提纯，得到化合物2：；

（3）在氮气保护下，化合物1、化合物2、EDC、HOBT和DIEA在DMF中反应，反应结束后分离提纯得到化合物3：；

（4）化合物3与水合肼在无水乙醇中反应，反应结束后分离提纯得到荧光探针。

所述β-氨基丙酸和对甲苯磺酰氯的摩尔比为1:1.2-1.5。

步骤（1）中，所述纯化步骤为：将沉淀冷水洗涤后，干燥，然后以二氯甲烷溶解，以体积比为5:1的石油醚:乙酸乙酯为淋洗液过柱层析。

步骤（2）中，所述分离提纯步骤为：将反应混合物浓缩，浓缩液以体积比为5:1的CH₂Cl₂:MeOH为淋洗液过柱层析。

步骤（3）中，所述分离提纯步骤为：将反应混合物浓缩，浓缩液以体积比为15:1的CH₂Cl₂:MeOH为淋洗液过柱层析。