[发明专利]绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体

说明书

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及绵羊Lrh‑1短发夹RNA及其干扰载体。本发明根据绵羊Lrh‑1基因的cDNA序列及设计原则筛选出靶序列，根据靶序列设计有短发夹RNA结构的单链寡核苷酸，经变性退火为双链寡核苷酸插入融合有绿色荧光的pENTR/U6载体，构建pENTR/U6‑shRNA‑GFP干扰载体。通过转染到湖羊卵巢颗粒细胞中，利用实时荧光定量PCR方法在mRNA水平检测，证实Lrh‑1‑shRNA干扰载体可以有效抑制绵羊体细胞中Lrh‑1基因的表达。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体。

背景技术

肝受体同系物-1(Liver receptor homolog-1,Lrh-1)是一种哺乳动物重要的核受体，属于核受体超家族中的NR5A亚家族的第2个成员，也称NR5A2，在动物的心、胃、肺、脑、胆囊、胰腺外分泌部、唾液腺、肠、卵巢、脂肪、膀胱、睾丸、肾上腺、胎盘等多种组织中均有表达。Lrh-1主要是以一种转录调控因子执行其功能，通过在不同时期的不同组织中调控多种蛋白的表达，从而影响这些组织的发育及生理生化功能，并在动物胚胎发育、分化、胆固醇代谢、胆汁酸的动态平衡、类固醇激素生成、乳腺癌的细胞转移和侵袭、组织炎症反应等过程中具有重要作用。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(doublestrand RNA，dsRNA)导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。RNA干扰技术的出现使得以特定的方式特异性沉默靶基因成为可能，并逐渐成为治疗疾病和基因功能研究的高效工具。目前，RNAi技术开辟了生命科学新的研究领域，成为21世纪国际生命科学的研究热点和前沿。

为了反向深入研究绵羊细胞中Lrh-1基因功能，需要对Lrh-1基因进行干扰、沉默、敲减或敲除，但目前尚未见Lrh-1基因的敲除或敲减的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体，该短发夹RNA能够对目的基因Lrh-1产生良好的敲减作用。

本发明提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其正义链5’→3’包括顺序连接的序列A、茎环序列1、序列B；其中，序列A与序列B反向互补；所述序列A如SEQ ID NO:1～3任一项所示。

本发明提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其反义链5’→3’包括顺序连接的序列A、茎环序列2、序列B；所述茎环序列2与茎环序列1反向互补。

本发明提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA中，反义链和正义链中的序列A是一致的，序列B也是一致的。

一些具体实施例中，所述序列A为GCACGGACTTACACCTATTGT(SEQID NO:1)，序列B为ACAATAGGTGTAAGTCCGTGC(SEQ ID NO:10)；

一些具体实施例中，所述序列A为GGAATAAGTTCGGGCCCATGT(SEQID NO:2)，序列B为ACATGGGCCCGAACTTATTCC(SEQ ID NO:11)；

一些具体实施例中，所述序列A为GCACAGGAATTGGTGGCAAAG(SEQ ID NO:3)，序列B为CTTTGCCACCAATTCCTGTGC(SEQ ID NO:12)；

本发明提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA的正义链和反义链的5’端皆连接有接头，所述正义链的接头序列为CACC；所述反义链的接头序列为AAAA。

本发明提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA中，所述茎环序列1的核酸序列为CGAA。茎环序列2的核酸序列为TTCG。