[发明专利]一种抗Dig的抗体及其在测序中的应用

说明书

本发明公开了一种抗Dig的抗体及其在测序中的应用，本发明的抗体包括选自SEQ ID NO:1‑4的重链可变区氨基酸序列和选自SEQ ID NO:9‑12的轻链可变区氨基酸序列。本发明的单克隆抗体能够特异性识别Dig抗原，将其与多个荧光素酶Nluc经化学偶联制备的Nluc‑Ab‑Dig能够特异性识别Dig‑dNTP上的Dig分子，当加入Nluc底物后，通过捕获Nluc的荧光信号来完成测序。本发明的单克隆抗体能够用作测序仪的重要测序酶原材料。本发明首次采用荧光素酶Nluc化学偶联标记Anti‑Dig，可提高测序结果的特异性和灵敏度，并首次将其用于测序仪的测序试剂盒。

技术领域

本发明涉及测序技术领域，尤其涉及一种抗Dig的抗体及其在测序中的应用。

背景技术

核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以核酸探针可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备探针，可用于疾病的诊断等研究。

核酸探针按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针是用放射性同位素作为标记物，是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物，常用的同位素有32P、3H、35S。其优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin，Dig)，二者都是半抗原。非放射性标记法可将生物素、地高辛连接在dNTP上，然后像放射性标记一样用酶促聚合法掺入到核酸链中制备标记探针。也可让生物素、地高辛等直接与核酸进行化学反应而连接上核酸链。

生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种从洋地黄类植物中提取的类固醇半抗体物质，在医学上可用于治疗各种急性和慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动等疾病。利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。但由于洋地黄植物的花和叶片是地高辛在自然界中的唯一来源，因此抗地高辛的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。这一点，正是地高辛胜于生物素的地方——同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问题。可地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。

1967年通过免疫动物首次成功制备抗地高辛抗体以来，已相继制成了地高辛特异的血清多克隆抗体、杂交瘤单克隆抗体等。目前市场上相关的产品主要包括抗地高辛多克隆、单克隆抗体及各种标记的抗体，如HRP-Anti-Dig，FITC-Anti-Dig等。广泛应用于抗原决定簇的抗原性分析鉴定，各种抗原、抗体的定量、定向及定位分析测定等。

免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。由于抗体与其相应抗原具有很高的亲和力，抗体标记主要用于对抗原的定位分析，在某些情况下，也可以对混杂有大量其他分子的样本中的抗原进行定量检测，是一种理想的快速价廉的定量测定方法。根据标记物的不同，抗体标记一般可以分为：荧光色素标记、生物素标记、酶标记三种。

其中酶标记抗体是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成，其应用范围非常广泛，结果即时可见、敏感性高。与辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶相比，荧光素酶分子量更小，且与底物的结合特异性很强，检出的灵敏度高，具有在哺乳动物组织中内源性的酶活性很低等优势。另外和荧光标记相比，荧光素酶标记的抗体不存在激发光的非特异性干扰，因此信噪比较高，具有较高的灵敏度。但目前只有在相关文献中查到将Nluc与IgG进行融合表达，并没有将抗体与Nluc进行化学偶联的方法报道。