[发明专利]一种培育抗逆杨树的基因工程方法

权利要求书

1.一种培育抗逆杨树的方法，其包括以下步骤：

(1)材料的选择；

(2)抗逆转录因子双基因载体pBIJEAR的构建；

(3)农杆菌介导的杨树叶片的遗传转化；

(4)转基因植株的分子检测；和

(5)温室移栽及抗逆性测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中所述的材料为未木质化和半木质化当年生枝条。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(2)中所述的构建为将来源于番茄的乙烯应答响应元件(JERF36#)和柠条的ABA响应元件结合蛋白基因(ckAREB)构建到同一植物表达载体上，从而构建JERF36-ckAREB双基因植物表达载体(pBIJEAR)，实现抗逆调控基因相对稳定串联。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤(3)中所述的遗传转化包括：

(1)叶片侵染；

(2)共培养；和

(3)选择培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的叶片侵染为取生长健壮的无菌苗叶片垂直于叶脉切3-4个切口，放入叶片再生培养基中，预培养1-3天，取出预培养叶盘浸入转化菌液中，侵染10-15min，期间轻微震荡，确保叶片与菌液充分接触。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述的共培养为取出叶盘，在无菌滤纸上吸干，接种到最佳叶片再生培养基上，27℃，黑暗条件下共培养2～3d。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述的选择培养为将农杆菌侵染后的叶片在附加Cef 300mg·L^-1的分化筛选培养基中培养，当抗性芽长至1.0～1.5cm时，再转入附加Cef 400mg·L^-1的生根筛选培养基中培养。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的分化筛选培养基为MS+6-BA 0.5mg·L^-1+NAA0.05mg·L^-1+Km 30mg·L^-1/Hyg 5mg·L^-1，生根筛选培养及为MS+IBA 0.01mg·L^-1+NAA0.01mg·L^-1+Km 20mg·L^-1/hyg 2mg·L^-1。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(4)中所述的转基因植株的分子检测为通过PCR、qRT-PCR进行检测，确定转基因植株。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(5)中所述的温室移栽及抗逆性测定为组培扩繁转基因株系，当苗高为3.0cm时，移栽至温室，选取生长健康、长势一致的转基因株系与非转基因株系，放置光照培养箱中培养，待各株系长至10cm左右，分别向各株系营养钵中浇20％PEG-6000和150mM NaCl，处理7天后，进行叶绿素含量及脯氨酸等生理指标的测定。