[发明专利]EGFR基因突变多重检测试剂盒

说明书

本发明提供了EGFR基因突变多重检测试剂盒，具体的地，本发明公开了一种多重检测EGFR基因突变的引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒，能够同时检测肺癌EGFR基因的28种突变类型，本发明的方法和试剂盒具有检测过程简单、可检突变类型多、灵敏度高、样本依赖性小等优点。

技术领域

本发明属于生物技术和肿瘤诊断领域，具体地说，本发明涉及EGFR基因突变多重检测试剂盒。

背景技术

肺癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)数量约占所有肺癌患者的85％，晚期非小细胞肺癌患者的5年生存率约为15％。随着技术的发展，肿瘤中发生的基因突变越来越受到人们重视，非小细胞肺癌具有高度的异质性，导致其临床表现及治疗效果极其多样化。

表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜蛋白，广泛分布于细胞膜上，为受体酪氨酸激酶家族成员之一。EGFR与表皮生长因子(EGF)的结合可启动细胞核内相关基因，从而促进细胞分裂增殖。EGFR存在于大多数细胞中，对肿瘤细胞的生长、繁殖、转移、新血管生成、浸润等起到重要作用，在非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中均有表达。

根据2018年美国国立综合癌症网络(NCCN)肺癌治疗指南，建议对非小细胞肺癌患者EGFR等基因的基因突变进行检查，这些基因的突变状态，与靶向药物的疗效息息相关，对多基因进行联合检测可进一步提高预测预后的准确性，对肺癌患者进行靶向用药具有指导意义。

目前基因突变常用的检测方法包括：sanger测序法、荧光PCR法、高分辨溶解曲线法、高通量测序法等。

①sanger测序法：检测基因突变需要对待测样品扩增、纯化、测序、序列分析，过程操作繁琐、耗时长，且对取材和技术要求比较高，并且由于自身的限制导致其灵敏度不高，仅可检测丰度超过20％的突变，假阴性较多。

②荧光PCR法：目前常用的基因突变检测方法，检测灵敏度高，可检出样品中含量低至1％的突变基因，且大幅缩短目标产物的长度，可解决石蜡包埋组织样本提取的DNA片段化的难题，从而获得较为准确的检测结果。荧光PCR法操作简单，能极大的避免扩增产物的污染。但该方法多用于检测单基因突变，多重基因检测在检测位点增多的同时设计难度成倍增加，因此虽然荧光PCR法拥有众多优点，但多重基因突变检测产品极少。

③高分辨率溶解曲线分析(HRM)：基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物溶解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确认具体位置，最终需要测序确认。

④高通量测序法：高通量测序法价格昂贵，读长大约30-250bp，比Sanger测序短，对序列拼接造成了负担，检测结果仍需要Sanger测序验证，并且对于检测外显子与内含子交界区的小片段缺失的准确性不够。高通量测序法操作繁琐，限制了测序速度。

因此，本领域迫切需要开发能够有效检测肺癌患者EGFR基因因突的技术以满足临床准确、快捷、低成本的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多重检测EGFR基因突变的试剂盒及方法。

在本发明的第一方面，提供了一种用于多重检测EGFR基因突变的引物对集，所述引物对集包括：

第一引物对组(3号管)，所述第一引物对组包括如SEQ ID NO.:22所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:8所示的反向引物。

在另一优选例中，所述第一引物对组还包括：

SEQ ID NO.:23所示的正向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括：