[发明专利]用于构建人单细胞TCR测序文库的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于构建人单细胞TCR测序文库的试剂盒，其特征在于包括：

微流控芯片，至少用于捕获人源T细胞单细胞并进行包装，从而生成油包水反应液滴，所述油包水反应液滴包括油相和被油相包裹的细胞液相，并且所述油包水反应液滴中包含有RNA反转录组件和细胞裂解试剂；

用于形成所述油相的油、细胞裂解试剂；

细胞标签，包括可变形微珠和连接在可变形微珠上的分子标签，所述分子标签用于标识细胞；

RNA反转录组件，包含SEQ ID NO:5所示反转录引物、RNA反转录酶、RNA反转录酶抑制剂和RNA反转录缓冲液；

cDNA预扩增组件，包含SEQ ID NO:6所示cDNA预扩增引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；

第一扩增组件，包含SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；

第二扩增组件，包含SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；

转座片段化组件，包含转座酶、转座酶反应缓冲液和转座反应终止液；

第三扩增组件，包含两个测序接头、DNA聚合酶和扩增缓冲液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述微流控芯片包括细胞微流道、细胞隔离介质微流道、细胞标签微流道和单细胞样本收集口，所述细胞微流道具有细胞悬液入口和单细胞悬液出口，所述细胞隔离介质微流道具有细胞标签悬液入口和细胞标签悬液出口，并且所述单细胞悬液出口与细胞标签悬液出口交会，使所述细胞微流道输出的单细胞悬液能够与所述细胞标签微流道输出的细胞标签悬液混合形成细胞载液，所述细胞载液的流动路径与所述细胞隔离介质微流道交叉，从而使在所述细胞隔离介质微流道内流动的细胞隔离介质能够剪切并包裹细胞载液，从而形成包含单细胞的油包水反应液滴，所述包含单细胞的油包水反应液滴由单细胞样本收集口输出。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞微流道的尾部区域设置为单细胞通道，所述单细胞通道的宽度等于或稍大于单细胞直径，所述单细胞通道的出口与细胞标签微流道的出口交会，使得从所述细胞微流道输出的单细胞悬液与从所述凝胶微珠分子标签微流道输出的凝胶微珠分子标签悬液混合形成细胞载液，所述细胞载液的连续流动路径与所述细胞隔离介质微流道交叉，使得流经所述细胞隔离介质微流道的细胞隔离介质能够将连续的细胞载液剪切为离散液滴状的细胞液相并使每一细胞液相包含单细胞和单个细胞标签，同时使所述细胞隔离介质作为油相对所述细胞液相进行包裹，从而形成所述油包水反应液滴。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述微流控芯片还包括分别与所述细胞微流道、细胞隔离介质微流道、细胞标签微流道连通的细胞悬液加样杯、细胞隔离介质加样杯、细胞标签加样杯。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述单细胞样本收集口处设置有负压动力生成装置，所述负压动力生成装置用于在微流控芯片内产生负压，从而驱使各微流道中的流体流动。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述油相包含油和细胞裂解试剂，所述细胞液相包含RNA反转录组件；优选的，所述油与细胞裂解试剂的体积比为100：1～500：1。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述分子标签能够在物理和/或化学作用下与所述可变形微珠分离，所述物理和/或化学作用包括光照或者特异性酶切；和/或，所述分子标签包括寡核酸链；和/或，所述分子标签包括用于标识细胞的条形码，所述条形码的长度为4-30nt；优选的，所述条形码包含3段以上的恒定碱基序列；更优选的，所述条形码包含3nt及以上的riboG碱基；和/或，所述分子标签的长度为50nt～200nt；和/或，所述可变形微珠的直径为10μm～200μm；和/或，所述可变形微珠包括多孔的聚丙烯酰胺微珠。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述第一扩增组件、第二扩增组件中任一种引物的使用浓度为0.1～0.5μmol/L。