[发明专利]硫胺素在促进人多能性干细胞向定型内胚层细胞分化中的应用

说明书

本发明公开硫胺素在促进人多能性干细胞向定型内胚层细胞分化中的应用。并进一步公开了一种用于人多能性干细胞向定型内胚层细胞分化的培养基，所述培养基包含基础培养基，硫胺素，生长因子和小分子化合物。本发明还提供了一种促进人多能性干细胞向定型内胚层细胞分化的方法。本发明首次发现硫胺素可以大幅提高诱导人多能性干细胞分化获得定型内胚层细胞的效率和纯度，将分化效率由55％～79％提高至94％～98％，为定型内胚层细胞下游分化提供良好的细胞资源。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域。更具体地，涉及硫胺素在促进人多能性干细胞向定型内胚层细胞分化中的应用。

背景技术

内胚层是三胚层之一，与中胚层、外胚层共同发育产生成体的所有器官。在早期胚胎阶段，内胚层细胞最初在原肠胚形成时期产生并发育成消化道包括肠、肝和胰腺，呼吸道包括肺和气管，以及甲状腺。所有这些器官在机体中发挥重要功能，功能缺失可能会引发致命疾病。然而，大多数构成这些器官的功能细胞难以实现体外培养，而且通过器官捐赠获得可移植的健康器官也存在供体数量的局限。所以，高质量的内胚层细胞的缺乏严重限制了该领域的发育生物学基础研究、疾病模型建立以及再生医学应用。

随着干细胞领域的迅速发展，由人多能性干细胞获得定型内胚层细胞及其衍生细胞越来越成为再生医学的热点。基于发育生物学中内胚层形成的基本原理，已经有一些研究团队能够成功地由人多能性干细胞分化获得相对均一的定型内胚层细胞。诱导定型内胚层细胞分化可选择的细胞外基质有纤连蛋白Fibronectin和玻连蛋白Vitronectin，需要激活的关键信号通路是Nodal/Activin信号通路，通过下游效应蛋白SMAD2/3调控内胚层的形成。其他信号通路例如WNT和FGF对于原条的形成和内胚层关键调控因子SOX17的表达是必需的。为了维持细胞增殖和分化过程中细胞存活率，需要使用营养添加剂，常用的营养添加剂包括血清、血清替代物或B27添加物。这些营养添加剂的使用向分化体系中引入动物源性成分，一方面影响批次间的稳定性，另一方面由于存在动物病毒感染的风险从而限制了定型内胚层细胞及衍生细胞在细胞替代治疗领域的应用。要建立化学成分明确、无动物源性的分化体系，需要避免血清、血清替代物、B27添加物等营养添加剂的使用。除此之外，在现有分化体系中，定型内胚层细胞的纯度有限，仅为60％～80％，仍有20-40％的细胞为其他类型的细胞。定型内胚层细胞的低纯度导致下游分化获得高质量的肝细胞、胰岛β细胞等衍生细胞的难度增加。

发明内容

本发明的一个目的在于提供硫胺素在促进人多能性干细胞向定型内胚层细胞分化中的应用。

本发明的第二个目的在于提供一种用于人多能性干细胞向定型内胚层细胞分化的培养基。

本发明的第三个目的在于提供一种促进人多能性干细胞向定型内胚层细胞分化的方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

根据上述第一个目的，本发明提供硫胺素在促进人多能性干细胞向定型内胚层细胞分化中的应用。

可选的，所述硫胺素的浓度为40～50mg/L。

根据上述第二个目的，本发明提供一种用于人多能性干细胞向定型内胚层细胞分化的培养基，其包含基础培养基，硫胺素，生长因子和小分子化合物。

可选的，所述硫胺素的浓度为40～50mg/L。

可选的，所述基础培养基包括DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基中的一种或几种。

可选的，所述生长因子包括ActvinA、TGFβ、Wnt3a中的一种或几种；优选的，ActvinA的浓度为10～300μg/L，Wnt3a的浓度为10～300μg/L，TGFβ的浓度为0.1～10μg/L。

可选的，所述小分子化合物包括PI3K信号通路抑制剂、微量元素中的一种或几种。