[发明专利]缓冲液组合物及其应用

说明书

本发明公开了缓冲液组合物及其应用，其中，该缓冲液组合物包括：通用缓冲液，所述通用缓冲液包括5‑25mMol通用Tris缓冲液、5‑20mMol通用二价阳离子、75‑150mMol通用一价阳离子、0.05‑2质量％表面活性剂和0.5‑2mMol二硫苏糖醇(DTT)，pH8‑10；以及连接缓冲液，所述连接缓冲液包括33‑66mM连接Tris缓冲液，0.5‑5mM连接二价阳离子、0.5‑10mM二硫苏糖醇(DTT)、5‑15％PEG4000‑8000和0.5‑2mM ATP，pH值为7‑9。由此，该缓冲液组合物能用于多样本的文库构建，并且，反应时间短，转化率高，错配率低。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及缓冲液组合物及其应用，更具体地，涉及一种缓冲液组合物、一种试剂盒，以及一种构建核酸文库的方法。

背景技术

对基因组DNA进行二代测序及相应的生物信息学分析，已经在医学健康领域和科技服务领域广泛应用。

二代测序文库的构建的一般流程如下：对目的DNA片段化；对片段化DNA进行末端平齐化处理；在平齐化后的DNA的3’末端突出腺苷酸化；将突出腺苷酸化的DNA片段与突出胸腺嘧啶化的双链Y型接头进行连接。现有的缓冲液体系样本兼容性差、也难以兼容不同的建库步骤，需要频繁更换缓冲液，延长了文库构建的时间，并且，转化效率低。而文库构建的目的即为在片段化DNA片段两段加上接头。而文库转化率(即双端加上接头的分子数与投入分子数的比值)为测得产量与理论最高产量质检的比值，即有多少起始样本被最终转化为两段接有接头的片段。转化率很大程度上受连接效率的影响，连接反应效率与酶反应效率、DNA链末端开放性、供体和受体的碰撞效率等多个因素相关，同时在连接反应体系中的接头还会产生自连消耗反应中的有效接头数量，是文库构建过程中的一个效率瓶颈。目前市场上通用的快速连接缓冲液其连接反应平台期高度有限，存在增大酶投入量以克服缓冲体系不匹配等情况，提高了实际应用的成本；另外在现有的连接缓冲液下连接时间无法向前推动酶反应平衡；且在预混过程中会产生大量错配降低了文库产量，限制了高通量工作流程的搭建。

由此，现有的建库中的通用缓冲液和连接缓冲液有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种缓冲液组合物，其中，通用缓冲液的兼容性好，稳定性高，适用于文库构建过程中的多步反应，而连接缓冲液有利于提高连接反应效率，降低错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种缓冲液组合物。根据本发明的实施例，该缓冲液组合物包括：通用缓冲液，所述通用缓冲液包括5-25mM通用Tris缓冲液、5-20mM通用二价阳离子、25-150mM通用一价阳离子、0.05-2质量％表面活性剂和0.5-2mM二硫苏糖醇(DTT)，pH8-10；以及连接缓冲液，所述连接缓冲液包括33-66mM连接Tris缓冲液，0.5-5mM连接二价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5 -15％ PEG4000-8000和0.5-2mM ATP，pH值为7-9。

根据本发明实施例的缓冲液组合物，通用缓冲液的兼容性好，稳定性高，适用于文库构建过程中的多步反应，使文库构建过程中的多步反应可以连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于提高构建DNA文库的方法的效率和稳定性，同时，对T4 DNA连接酶无明显的抑制作用。而连接缓冲液增加底物的转化率，降低连接反应的错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，同时，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。由此，本发明实施例的通用缓冲液和连接缓冲液组成的缓冲液组合物，能用于多样本的文库构建，并且，反应时间短，转化率高，错配率低。

另外，根据本发明上述实施例的缓冲液组合物还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述通用二价阳离子和所述连接二价阳离子均为Mg²⁺或Ca²⁺。