[发明专利]一种动态调控脂肪酸代谢途径强化柚皮素合成的方法

说明书

本发明公开了一种动态调控脂肪酸代谢途径强化柚皮素合成的方法动态调控策略调节脂肪酸代谢途径积累丙二酰‑CoA，并进一步强化柚皮素合成的方法，属于代谢工程技术领域。本发明以柚皮素响应蛋白FdeR为基础，利用基因过表达技术和反义RNA抑制技术等调控手段，结合组成型表达柚皮素合成途径，从而建立了一种可感应胞内柚皮素含量的动态循环放大系统，强化柚皮素合成，使柚皮素产量提升到原来的3.2倍，达95.1mg/L。本发明实现了细胞生长和产物合成之间的平衡，所述方法为其他高附加值化合物生产菌株的代谢工程改造提供方法借鉴。

技术领域

本发明涉及一种动态调控脂肪酸代谢途径强化柚皮素合成的方法，属于代谢工程技术领域。

背景技术

黄酮类化合物是一类广泛存在与植物组织中的天然产物，具有多种生理功能，如抗癌、抗炎症、抗衰老、调节人体激素水平、抗氧化和保肝护肝等功能，已经被广泛应用于食品和药品中。所有黄酮类化合物都含有三个碳原子连接两个苯环所构成的核心骨架。柚皮素是一种具有最多衍生物的黄酮骨架类物质，经过对柚皮素的后续化学或酶法催化修饰，适当的羟基化、甲基化、糖基化等催化反应，即可生成具有更高附加值和功能多样的黄酮类化合物。

大肠杆菌合成柚皮素等黄酮类化合物过程中，胞内丙二酰-CoA的供给不足是导致最终产量较低的重要原因。胞内丙二酰-CoA绝大部分流向脂肪酸合成途经。此外丙二酰-CoA的前体物质乙酰-CoA大部分进入TCA循环，为菌体生长提供必需的能量。这些都导致了较低的丙二酰-CoA胞内含量。利用代谢工程手段过多的积累胞内丙二酰-CoA不仅会影响菌体生长，还会造成胞内过多的脂酰-CoA衍生物积累，从而进一步影响细胞整体蛋白组的酰基化水平。目前已有报道中，研究者主要通过抑制胞内脂肪酸合成途径积累丙二酰-CoA。Leonard等通过添加浅蓝菌素抑制脂肪酸合成相关基因(fabB/fabF)，分别得到700mg/L和113mg/L的黄酮和花青素。通过强化丙二酰-CoA合成途径来积累丙二酰-CoA同样获得了较大进展。Leonard等和Zhu等通过过表达来自谷氨酸棒状杆菌的乙酰-CoA羧化酶(ACC)极大地提升了黄酮类化合物的产量。

然而，上述静态调控系统调控丙二酰-CoA合成需要在合适的时间添加诱导剂，诱导时间、诱导剂浓度和菌体的生长状态等都对最终产量具有较大影响。同时，由于丙二酰-CoA与细胞生长息息相关，过量积累丙二酰-CoA不仅会严重影响细胞生长，还会影响细胞的蛋白质组酰基化水平而进一步改变胞内代谢环境。因此，构建稳定、高效、可动态调节细胞生长和产物合成的柚皮素生产平台菌株至关重要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种动态响应柚皮素含量调控脂肪酸合成途径的方法，强化胞内丙二酰-CoA积累，从而进一步强化柚皮素合成。

本发明的第一个目的是提供一种动态响应柚皮素含量调控脂肪酸合成途径的方法，是利用动态响应柚皮素含量的生物传感器调控脂肪酸合成途径，所述生物传感器包括柚皮素响应的调控蛋白FdeR和受FdeR调控的启动子P_fdeA，所述调控蛋白FdeR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述调控蛋白FdeR的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P_fdeA包括P_fdeA(180-1)、P_fdeA(223-1)、P_fdeA(250-1)、P_fdeA(288-1)、P_fdeA(223-50+RBS)、P_fdeA(223-83+RBS)、P_fdeA(223-135+RBS)或P_fdeA(223-180+RBS)。所述P_fdeA(288-1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。