[发明专利]一种短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法

说明书

本发明提供一种短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法。所述短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法包括以下步骤：S1：建立基于AFM的微纳加工系统；S2：利用微纳加工系统和机械‑化学相结合的方法制作可控自组装芳香烃单层膜；S3：将DNA探针固定在所述芳香烃偶连层修饰的硅表面；S4：对DNA进行检测和表征。本发明提供的短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法具有利用微纳制造技术中的机械‑化学方法来实现硅表面可控自组装单链DNA的制备，解决目前DNA探针制备存在的尺寸、位置和形状都不可控的问题的优点。

技术领域

本发明涉及建筑技术领域，尤其涉及一种短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法。

背景技术

由于基因组及后基因组计划的开展，近年来基于杂交特异性而发展起来的DNA识别技术得到了迅速的发展，DNA检测和识别技术将大量DNA探针以一定的阵列固定在表面上，通过一次实验即可得出大量的序列信息，在基因组计划中起到了重要的作用并得到了长足的发展。简单的说就是成千上万的DNA分子作为探针以有序或者无序的方式通过共价键或者非共价键排列到微型化的基底表面(可以是尼龙膜，硝酸纤维素膜，玻片，云母片，硅片等)[1-5]，分别与常人和患者DNA杂交和比对分析，就能获得病变的DNA信息，成为一项诊断新技术。

DNA检测技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析。

1、芯片制备-制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。

2、样品制备-生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。

3、杂交反应-杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。

4、信号检测和结果分析-杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。

上述四个步骤中，DNA探针固定是DNA检测技术的关键问题，要构筑DNA芯片，首先必须先将与待测靶分子碱基序列互补的探针修饰到基底材料上，构筑一个识别层，然后才能根据碱基互补原则通过杂交反应检测其互补片段。探针固定是研究中的核心技术和首要问题。因此，借助有效的物理、微纳制造技术和化学修饰方法在硅片表面构筑识别层已成为广大科技工作者竞相研究和探索的目标。

基因芯片的制备主要依赖于微细加工(microfabrication)、自动化(automatism)及化学合成技术。通常比较典型的DNA探针固定的方法有：

(1)吸附法：

吸附法是通过非共价键作用将直接或恒电位吸附而修饰到基底材料表面，或由片段中带负电荷的磷酸骨架与带正电荷的基底材料表面修饰层通过静电作用而固定。该法不需要特殊试剂或对分子进行特殊修饰衍生化，固定速度快。传统生物学实验中就是通过吸附方法固定到尼龙膜上。吸附法是一种最简便固定DNA的方法，但通过吸附固定DNA在高盐浓度环境中容易从电极表面脱落，所以不宜在高盐浓度条件下使用。另外，它是多位点吸附形式，通过中子反射研究[6-7]显示：固定的DNA可能平躺在电极表面，减小DNA固定化密度，同时使DNA片段运动自由度减小，影响杂交效率。因此吸附法不是DNA芯片和传感器研究的最佳选择。

(2)SAM法(self-assembly monolayer)：