[发明专利]人源化细胞因子IL3基因改造非人动物的构建方法及应用

权利要求书

1.一种人源化IL3基因改造非人动物的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL3基因改造非人动物的基因组中包含嵌合IL3基因，所述的嵌合IL3基因中来源于人IL3基因的部分如SEQ ID NO：33所示，所述的嵌合IL3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的人源化IL3基因改造非人动物体内表达人IL3蛋白，所述的非人动物为免疫缺陷的小鼠。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括使用靶向IL3基因的sgRNA和/或靶向载体用编码人IL3蛋白的核苷酸序列替换非人动物IL3基因的外显子1至外显子5的部分核苷酸序列，使得所述非人动物体内表达人IL3蛋白；

其中，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列包含人IL3基因的部分核苷酸序列，所述的供体DNA序列如SEQ ID NO：33所示，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，所述5’臂核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，所述3’臂核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；其中，所述的待改变的转换区位于IL3基因的外显子1至外显子5；

所述的sgRNA在待改变的IL3基因上的靶序列上是唯一的，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：8所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：20所示。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的嵌合IL3基因编码人IL3蛋白；所述的嵌合IL3基因的核苷酸序列转录的mRNA序列如SEQ ID NO：42所示。

4.一种IL3基因经遗传修饰的小鼠细胞，其特征在于，所述的细胞中包含嵌合IL3基因，所述的嵌合IL3基因中来源于人IL3基因的部分如SEQ ID NO：33所示，所述细胞表达人IL3蛋白，所述的细胞不能发育为动物个体。

5.一种IL3基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列包含人IL3基因的部分核苷酸序列，所述的供体DNA序列如SEQ ID NO：33所示，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，所述5’臂核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，所述3’臂核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；其中，所述的待改变的转换区位于IL3基因的外显子1至外显子5。

6.一种特异的靶向IL3基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA在待改变的IL3基因上的靶序列上是唯一的，所述的sgRNA在非人动物IL3基因的靶位点位于非人动物IL3基因的外显子1和/或外显子5上，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：8所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：20所示，所述的非人动物为免疫缺陷的小鼠。

7.一种制备多基因人源化非人动物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（a）利用权利要求1-3任一所述的构建方法获得非人动物；

（b）将步骤（a）制备获得的非人动物与其他基因人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化非人动物，所述的非人动物为免疫缺陷的小鼠。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的其他基因人源化动物选自基因IL6、IL15、CSF1、CSF2或SIPRA人源化动物中的一种或两种以上的组合。

9.一种嵌合IL3基因，其特征在于，所述的嵌合IL3基因为人IL3基因的部分核苷酸序列与非人动物IL3基因的部分核苷酸序列的嵌合，所述的嵌合IL3基因编码人IL3蛋白，所述的非人动物为免疫缺陷的小鼠，所述的嵌合IL3基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：

a）如SEQ ID NO：5所示；

b）转录的mRNA序列如SEQ ID NO：42所示。

10.来源于权利要求1-3任一所述的构建方法获得的人源化IL3基因改造非人动物、权利要求4所述的细胞或权利要求7-8任一所述的方法制备的多基因人源化非人动物在筛选、验证、评价或研究IL3基因功能，在针对IL3靶位点的药物的功能研究和/或构建疾病模型中的药效研究中的应用，所述的应用为非疾病的诊断或者治疗方法。