[发明专利]一种从乳杆菌中提取肽聚糖的方法

说明书

本发明涉及一种瑞士乳杆菌MB2‑1(Lactobacillus helveticus MB2‑1)肽聚糖的提取方法。特点是运用物理和化学方法增加细胞壁的通透性，物理方法是采用超声波破碎法，化学方法是采用三氯乙酸法抽提磷壁酸使细胞膜通透性增加。通过有机试剂脱脂去除细胞膜上的脂肪类物质，再用复合酶解液去除细胞内的蛋白质类物质，最后通过离心清洗去除杂质后冻干即获得肽聚糖。本发明的优点在于：提取的具有益生作用的完整肽聚糖在制备方法上实用性强、操作简单、周期短、步骤简便合理、成本低、产率高、适宜规模化生产。

技术领域

本发明涉及肽聚糖的制备方法，尤其是涉及一种物理化学方法提取瑞士乳杆菌肽聚糖的制备方法。

背景技术

乳酸菌作为一种重要的肠道益生菌，是人及动物肠道中极为重要的生理菌群之一。乳酸菌不仅无毒、无害、无副作用，而且具备多方面的保健功能，如调节肠道菌群、维持肠道微生态平衡、缓解乳糖不耐症、降低胆固醇、降血压、增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤和抗突变等。研究表明，乳酸菌的益生功效可通过其本身的初级代谢作用实现，另外也与乳酸菌自身的结构有关，如与细胞壁上的肽聚糖密切相关。相应地，有关这些乳酸菌组成成分的分离提取、活性研究、结构分析已成为当前研究的热点。瑞士乳杆菌是乳酸菌家族中重要一员，已有研究表明其在抗氧化、抗肿瘤、调整肠道菌群平衡及提高免疫功能等方面发挥重要作用。

肽聚糖(peptidoglycan，PGN)为革兰氏阳性细菌细胞壁的主要成分，其基本结构是由N-乙酰葡糖胺与N-乙酰胞壁酸通过(β-1，4糖苷键连接，并在重复的单元之间通过四肽或者五肽的桥连结构构成的多聚网络结构。PGN作为一种免疫增强剂，对其在诱导有关免疫调控因子的释放来刺激免疫系统发挥其抗感染、抗肿瘤等生物效应方面的研究已初见成效，但其激活巨噬细胞的具体信号通路以及它在免疫系统中的作用机理仍需进一步探索。对天然免疫强化剂PGN的高效分离利用，将为生物病害防治提供更多且可靠的依据。

肠道益生菌细胞壁PGN的免疫学研究，目前主要集中在双歧杆菌PGN方面。乳酸菌的益生活性已被广大消费者所接受，其抗氧化性和改善肠道菌群平衡的功能也被众多研究者所证实，但对于其在细胞免疫调控中的具体作用，国内外研究还未达成一定的共识，且对于PGN通过何种途径发挥免疫学活性也未进行深入的研究。本研究已完成对肽聚糖的提取、分离纯化、结构分析及生理活性的研究，并计划对PGN成分在细胞胞内免疫信号传递中的作用进行了深层次的探究。本发明为深入了解乳酸菌PGN在免疫系统中的作用机制打下基础，为将来研制出益生功能明确、保健功能突出的新型保健发酵品和肽聚糖类药物饮品提供坚实的理论基础和技术支持。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提取产量高纯度高的肽聚糖方法。

本发明提供了一种生产周期短、操作简单、溶剂使用少、生产成本低廉的完整肽聚糖制备方法。

本发明的目的由如下技术方案实施：通过物理法超声法和化学SDS法相结合的方法增加细菌细胞壁的通透性，利用三氯乙酸抽提去除细胞壁中的磷壁酸，再利用有机溶剂脱脂去除细胞膜上的脂肪类物质使酶更好的作用于细胞内容物，然后用复合酶解液去除细胞内的蛋白质类物质，最后通过透析离心清洗去除杂质后冻干即获得的完整肽聚糖。

本发明由如下详细技术方案实施：

(1)菌体的制备

将瑞士乳杆菌活化两次，在37℃连续培养24h。达到稳定期后，将发酵液中的菌体于6000×g离心分离25min，收集沉淀并用生理盐水离心清洗3次。

(2)菌体的裂解

获得的菌体添加在4％的SDS溶液中煮沸30min，以促使菌体裂解和胞内成分溶出。置于4℃降温5min，将菌体沉淀于6000×g常温下离心25min，去除上清液后，用去离子水离心清洗至SDS痕量为止。

(3)菌体细胞壁通透性的增加