[发明专利]一种铜绿假单胞菌的CPA检测引物、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种铜绿假单胞菌的CPA检测引物、试剂盒及方法。该CPA检测引物是针对靶点oprL设计的，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示。本发明还提供一种铜绿假单胞菌的CPA检测试剂盒，其具有灵敏度高、特异性好，适用性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低等优点。利用上述CPA检测引物或CPA检测试剂盒对待测样品进行交叉引物恒温扩增反应，可通过荧光染料显色对结果直接进行肉眼判读，快速、准确的检测出待测样品中是否含有铜绿假单胞菌，这对于提高重大群体疾病诊断率，早期的疾病诊断具有非常重要的意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌的CPA检测引物、试剂盒及方法。

背景技术

目前微生物的检测鉴定方法主要分为培养鉴定法、免疫检测法及核酸检测。传统培养鉴定法操作繁琐、实验周期长，免疫检测法对实验人员要求高，核酸检测主要集中于PCR检测耗时长，灵敏度低。

交叉引物恒温扩增(Crossing Priming Amplification,CPA)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但该反应引物设计难度较高，需要在有限的产物长度中设计五条引物，且避免五条引物自身发生非特异性扩增而影响结果，因此引物的设计尤为重要。

铜绿假单胞菌对营养要求较低，广泛存在于土壤、地表水及污水中，可通过水源、土壤、工器具、接触等多种途径传播，且对常规水处理技术如紫外线、臭氧和二氧化氯等均有很强的抵抗力。在凉拌菜、熟肉制品、饮用水等产品中经常存在铜绿假单胞菌污染的情况。特别是其在桶装饮用水中的污染屡见报道，已逐渐成为桶装饮用水质量不合格的主要指标。该菌可产生多种毒素致病因子,如ADP-糖基转移酶、荧光色素、β-内酰胺酶等,导致急性肠道疾病、皮肤炎症等疾病,甚至引发肺炎、脑膜炎、败血症等严重急性感染。因此，建立一种可视化的快速检测铜绿假单胞菌的检测体系十分重要。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种铜绿假单胞菌的CPA检测引物。

本发明的另一目的在于提供一种铜绿假单胞菌的CPA检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种铜绿假单胞菌的CPA检测方法。该方法具有灵敏度高(灵敏度达到了796fg/μL，是PSR反应灵敏度的10～100倍)、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用的特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种铜绿假单胞菌的CPA检测引物，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：

剥离引物4s：5’-GACCCGAACGCAGGCTAT-3’(SEQ ID NO.1)；

剥离引物5a：5’-CGCTGCCTTTCAGGTCTTT-3’(SEQ ID NO.2)；

交叉引物2a1s：5’-GCATGGCTTCCGGCTTCAGTGCGATCACCACCTTCTACTT-3’(SEQ IDNO.3)；

特异引物2a：5’-GCATGGCTTCCGGCTTCA-3’(SEQ ID NO.4)；

特异引物3a：5’-GTCGGAGCTGTCGTACTC-3’(SEQ ID NO.5)。

所述的铜绿假单胞菌优选为铜绿假单胞菌ATCC27853，铜绿假单胞菌ATCC10145，铜绿假单胞菌ATCC15442，铜绿假单胞菌ATCC17934和铜绿假单胞菌ATCC35032中的至少一种。

一种铜绿假单胞菌的CPA检测试剂盒，包括上述铜绿假单胞菌的CPA检测引物。